PC-12細胞における細胞生存率および細胞内酸化ストレスに対するβ-HgSの効果

Effects of β-HgS on cell viability and intracellular oxidative stress in PC-12 cells.

• Lujing Geng
• Zhenghua Xia
• Lu Yuan
• Cen Li
• Ming Zhang
• Yuzhi Du
• Lixin Wei
• Hongtao Bi

抄録

β-HgSを含むチベットの伝統的な薬は、何千年も前から慢性疾患の治療に使用されてきました。しかし、最近では、水銀含有量が高いため、これらの薬の安全性についての憶測があります。β-HgSの毒性については、これまでに生体内での研究が行われてきたが、そのメカニズムは不明であった。本研究では、ラット副腎腫瘍細胞（PC-12）を用いた実験により、β-HgSの細胞毒性のメカニズムを明らかにした。具体的には、異なる濃度のβ-HgSで処理したPC-12細胞の生存率と細胞内酸化ストレス状態を解析した。比較目的のために、２つのＨｇベースの化合物であるＭｅＨｇＣｌおよびＨｇＣｌ２の活性酸素生成およびＭＤＡ、ＧＳＨ／ＧＳＳＧ、Ｎｒｆ２、ＮＱＯ-１およびＨＯ-１レベルへの影響も決定する。特筆すべきは、システインなどの細胞培養液の低分子チオール類を用いてβ-HgSの溶解度を高め、PC-12細胞を治療するためのβ-HgS溶液を調製したことである。得られた結果、β-HgSは200-1000ng Hg mL-1の濃度（48時間処理）で細胞の生存率を阻害することがわかった。200-600 ng Hg mL-1 (24時間処理)の濃度範囲では、β-HgSの阻害効果はMeHgClよりも強いが、高濃度(800-1000 ng Hg mL-1)と長時間(48時間)ではこの傾向が逆転することがわかった。さらに、β-HgSはMDAを有意に促進するが、PC-12細胞のアポトーシスや活性酸素の発生にはほとんど影響を及ぼさないことから、細胞の生存率を抑制する効果は活性酸素に依存しない酸化ストレスの刺激に関係している可能性が示唆された。また、β-HgSとHgCl2はPC-12細胞のGSH含量、GSH/GSSG比、NQO-1 mRNA発現、HO-1タンパク質発現を有意に増加させ、これらの化合物に対する抗酸化保護作用がNrf2の活性化によって引き起こされていることが示唆された。HPLC-AFS分析の結果、β-HgS溶液とHgCl2溶液では、水銀は同じ形でHg2+として存在するが、細胞毒性は前者の方が大きいことがわかった。これは、β-HgS中のS2-イオンによって誘導される追加の酸化的損傷によるものと考えられる。結論として、β-HgSはPC-12細胞においてROSに依存しない酸化ストレスを誘導するため、明らかに細胞毒性がある。同時に、Nrf2経路を活性化することで細胞の抗酸化能を促進する。

Traditional Tibetan medicines containing β-HgS have been used to treat chronic ailments for thousands of years. However, there has recently been speculation regarding the safety of these medicines due to their high mercury content. Although the toxic effect of β-HgS has been previously investigated in vivo, the mechanism underlying the toxicity of this compound remains unclear. In this study, we investigate the mechanism of β-HgS cytotoxicity via experiments performed on rat adrenal gland tumor cells (PC-12). Specifically, we analyze the viability and intracellular oxidative stress state of PC-12 cells treated with varying concentrations of β-HgS. For comparison purposes, the effects of MeHgCl and HgCl2, two Hg-based compounds, on ROS generation and MDA, GSH/GSSG, Nrf2, NQO-1, and HO-1 levels are also determined. It should be noted that we used the small-molecule thiols of cell culture medium, such as cysteine, to increase the solubility of β-HgS and prepare a β-HgS solution to treat PC-12 cells. The obtained results show that β-HgS inhibits cell viability at concentrations of 200-1000 ng Hg mL-1 (48 h treatment). In the concentration range of 200-600 ng Hg mL-1 (24 h treatment), the inhibitory effect of β-HgS is stronger than that of MeHgCl; however, this trend is reversed at higher concentrations (800-1000 ng mL-1) and longer exposure times (48 h). Moreover, β-HgS significantly promotes MDA, but has no appreciable influence on cell apoptosis and ROS generation in PC-12 cells, which suggests that its inhibitory effect on cell viability might be related to the stimulation of ROS-independent oxidative stress. Notably, β-HgS and HgCl2 significantly increase the GSH content, GSH/GSSG ratio, NQO-1 mRNA expression, and HO-1 protein expression in PC-12 cells, indicating that the antioxidant protection against these compounds is triggered by Nrf2 activation. HPLC-AFS analysis shows that in β-HgS and HgCl2 solutions, mercury exists in the same form of Hg2+, but the cytotoxicity of the former is greater. This is probably due to the additional oxidative damage induced by the S2- ion in β-HgS. In conclusion, β-HgS induces ROS-independent oxidative stress in PC-12 cells, and thus, is obviously cytotoxic. At the same time, it promotes the antioxidant capacity of cells by activating the Nrf2 pathway.