早期停止コドンを持つmRNAを編集するツールとしてのREPAIRv2の検討

Investigating REPAIRv2 as a Tool to Edit mRNA with Premature Stop Codons.

• Raffaella Melfi
• Patrizia Cancemi
• Roberta Chiavetta
• Viviana Barra
• Laura Lentini
• Aldo Di Leonardo

抄録

嚢胞性線維症（CF）は、膜貫通コンダクタンスレギュレーター（CFTR）タンパク質をコードする遺伝子の突然変異によって引き起こされる。一部のＣＦ患者は、この遺伝子のナンセンス変異の複合ヘテロ接合体またはホモ接合体である。このことは、ＣＦＴＲタンパク質が切り捨てられ、より重症化する原因となる早期終結コドン（ＰＴＣ）が転写物中に存在することを示唆しています。アミノグリコシドおよびＰＴＣ１２４誘導体は、完全長のＣＦＴＲタンパク質を復元するために、ＰＴＣのリードスルーに使用されてきた。しかし、精密医学の枠組みでは、CRISPR/dCas13bベースの分子ツール )は、完全長CFTRタンパク質を復元するための良い代替手段となり得る。このRNA編集アプローチは、dCas13bタンパク質に融合したhADAR2酵素のデアミナーゼドメインを特定のアデノシンにターゲティングして、変異体mRNAをイノシンに編集することに基づいています。標的特異性は、標的領域に相補的にガイドＲＮＡ（ＲＮＡ）によって許容され、ｄＣａｓ１３ｂタンパク質によって認識される。ここで、我々はREPAIRv2プラットフォームを使用して、異なる細胞型、すなわち、IB3-1細胞、HeLa、およびH2BGFPおよびCFTRをそれぞれ発現するように改変されたFRT細胞において、UGA PTCをUGGに編集した。

Cystic fibrosis (CF) is caused by mutations in the gene encoding the transmembrane conductance regulator (CFTR) protein. Some CF patients are compound heterozygous or homozygous for nonsense mutations in the gene. This implies the presence in the transcript of premature termination codons (PTCs) responsible for a truncated CFTR protein and a more severe form of the disease. Aminoglycoside and PTC124 derivatives have been used for the read-through of PTCs to restore the full-length CFTR protein. However, in a precision medicine framework, the CRISPR/dCas13b-based molecular tool ) could be a good alternative to restore the full-length CFTR protein. This RNA editing approach is based on the targeting of the deaminase domain of the hADAR2 enzyme fused to the dCas13b protein to a specific adenosine to be edited to inosine in the mutant mRNA. Targeting specificity is allowed by a guide RNA (RNA) complementarily to the target region and recognized by the dCas13b protein. Here, we used the REPAIRv2 platform to edit the UGA PTC to UGG in different cell types, namely IB3-1 cells, HeLa, and FRT cells engineered to express H2BGFP and CFTR, respectively.