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細菌性チチジンデアミナーゼ毒素は、CRISPRフリーのミトコンドリア塩基編集を可能にする
A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing.
PMID: 32641830 DOI: 10.1038/s41586-020-2477-4.
抄録
細菌毒素は、生物医学的応用のために再利用することができる生化学的多様性の膨大な貯蔵庫を表している。このようなタンパク質には、デアミナーゼスーパーファミリーの予測される細菌間毒素のグループが含まれており、これらのメンバーは、遺伝子編集技術への応用が見出されています。これまでに説明されたシチジンデアミナーゼは一本鎖の核酸に作用するため、塩基編集に使用するには、例えばCRISPR-Cas9システムによる二本鎖DNA（dsDNA）の巻き戻しが必要である。しかし、ミトコンドリアDNA（mtDNA）内での塩基編集は、これまでのところ、ガイドRNAのミトコンドリアへの送達に関連した課題によって妨げられていました。その結果、これまでのmtDNAの操作は、デザイナーヌクレアーゼによるミトコンドリアゲノムの破壊を標的としたものに限られていた。その結果、このような細菌間毒素は、2本のDNAの中のシチジンの除去を触媒することがわかった。スプリットDddAハーフ、転写アクチベーター様エフェクターアレイタンパク質、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤を融合させた結果、RNAを含まないDddA由来のシトシン塩基編集剤（DDCBE）が誕生した。我々は、DdCBEsを用いて、ヒト細胞における疾患に関連したmtDNAの突然変異をモデル化し、呼吸速度と酸化的リン酸化の変化をもたらした。CRISPRを用いないDdCBEは、標的とするヌクレアーゼによるmtDNAの切断に起因するmtDNAコピーの除去ではなく、mtDNAの正確な操作を可能にし、ミトコンドリア疾患の研究や潜在的な治療への幅広い意味合いを持っています。
Bacterial toxins represent a vast reservoir of biochemical diversity that can be repurposed for biomedical applications. Such proteins include a group of predicted interbacterial toxins of the deaminase superfamily, members of which have found application in gene-editing techniques. Because previously described cytidine deaminases operate on single-stranded nucleic acids, their use in base editing requires the unwinding of double-stranded DNA (dsDNA)-for example by a CRISPR-Cas9 system. Base editing within mitochondrial DNA (mtDNA), however, has thus far been hindered by challenges associated with the delivery of guide RNA into the mitochondria. As a consequence, manipulation of mtDNA to date has been limited to the targeted destruction of the mitochondrial genome by designer nucleases.Here we describe an interbacterial toxin, which we name DddA, that catalyses the deamination of cytidines within dsDNA. We engineered split-DddA halves that are non-toxic and inactive until brought together on target DNA by adjacently bound programmable DNA-binding proteins. Fusions of the split-DddA halves, transcription activator-like effector array proteins, and a uracil glycosylase inhibitor resulted in RNA-free DddA-derived cytosine base editors (DdCBEs) that catalyse C•G-to-T•A conversions in human mtDNA with high target specificity and product purity. We used DdCBEs to model a disease-associated mtDNA mutation in human cells, resulting in changes in respiration rates and oxidative phosphorylation. CRISPR-free DdCBEs enable the precise manipulation of mtDNA, rather than the elimination of mtDNA copies that results from its cleavage by targeted nucleases, with broad implications for the study and potential treatment of mitochondrial disorders.