引っ張り力研究で明らかになったプリオンタンパク質の転座機構の裏付けデータ

Supporting data on prion protein translocation mechanism revealed by pulling force studies.

• Theresa Kriegler
• Sven Lang
• Luigi Notari
• Tara Hessa

抄録

プリオンタンパク質（PrP）は、高度に保存された細胞表面糖タンパク質です。PrP前駆体は、分泌経路に入るために、Sec61複合体と複数の付属因子が小胞体（小胞体）膜に集まっていることに依存しています。PrPのトップジェネシスは、異なるPrPアイソフォームの形成をもたらします。典型的な分泌型（PrP）とは別に、神経変性疾患に関連した様々な膜包埋型（PrPとPrP）が存在することが知られています[1]。本論文では、"Prion Protein Translocation Mechanism Revealed by Pulling Force Studies" (Kriegler etal., May 2020)[2]に関連する支持的なデータを提供します。本研究では、PrPがERに挿入される際に経験する共翻訳フォールディングの研究を行っている。本論文では、APを介したリボソーム失速アッセイの方法を、実験データと併せて記述する。さらに、AP媒介リボソーム失速と半透過性ヘラ細胞（SPC）を小胞体膜源として用いた場合についても記述する。この実験的セットアップを用いて、特定の膜コンポーネントであるERタンパク質トランスロカーゼのサブユニットがPrPナッセント鎖に力を発揮する牽引因子として寄与しているかどうかを直接的に決定することができる。ここで紹介するデータは、(a)オートラジオグラフィーで可視化したSDS-PAGEゲル画像、(b)AP媒介リボソームストール法で観察されたPrP種の異なる集団の定量化、(c)ER膜ドナーとしての犬の膵臓マイクロソームと比較したSPCで測定された引っ張り力プロファイルの計算式をカバーしています。最後に、ウエスタンブロット分析および各種トランスロケーション成分のコントロール条件と比較したsiRNAノックダウンレベルの定量を示す。

The Prion protein (PrP) is a highly conserved cell surface glycoprotein. To enter the secretory pathway, the PrP precursor relies on the Sec61 complex and multiple accessory factors all gathering at the membrane of the Endoplasmic reticulum (ER). PrP topogenesis results in the formation of different PrP isoforms. Aside from the typical secretory variant (PrP) different pathognomonic, membrane-embedded variants (PrP and PrP) that are associated with neurodegenerative diseases can be found [1]. In this article, we provide supportive data related to "Prion Protein Translocation Mechanism Revealed by Pulling Force Studies" (Kriegler et al., May 2020)[2], where we utilize Xbp1 arrest peptide (AP)-mediated ribosomal stalling to study the co-translational folding experienced by PrP during its insertion into the ER. We measure translocation efficiency and characterize the force exerted on PrP nascent chain so called "pulling force profile". Here, we describe the method of AP-mediated ribosomal stalling assay together with additional experimental data to the main article. Furthermore, we describe the combination of AP-mediated ribosomal stalling and semi-permeabilized Hela cells (SPCs) as ER membrane source. Using this experimental set-up one can directly determine the contribution of a specific membrane component, subunits of the ER protein translocase, as pulling factor exerting force on the PrP nascent chain. The data presented here covers (a) the SDS-PAGE gel images visualized by autoradiography, (b) quantification of the different populations of PrP species observed in the AP-mediated ribosomal stalling method, and (c) calculation formulas of the pulling force profiles measured in SPCs in comparison to dog pancreas microsomes as ER membrane donor. Finally, Western Blot analysis and quantification of siRNA knockdown levels compared to control conditions of various translocation components are shown.

© 2020 The Authors. Published by Elsevier Inc.