アラキドン酸は、カルシウムイオンの非存在下で、5-リポキシゲナーゼ活性化タンパク質を含むナノディスクへの5-リポキシゲナーゼの結合を促進する

Arachidonic acid promotes the binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs containing 5-lipoxygenase activating protein in the absence of calcium-ions.

• Ramakrishnan B Kumar
• Pasi Purhonen
• Hans Hebert
• Caroline Jegerschöld

抄録

炎症の最初のステップのうち、細胞膜に貯蔵されたアラキドン酸（AA）のロイコトリエンへの変換がある。この変換は主に白血球で行われ、2つのタンパク質の相互作用に依存しています：5-リポキシゲナーゼ（5LO）は、使用されるまで核膜から離れて保管され、5-リポキシゲナーゼ活性化タンパク質（FLAP）は、膜貫通型のホモ3量体タンパク質であり、核膜内に構成的に存在しています。我々は以前に負のリンタングステン酸ナトリウムで染色されたサンプル上の透過型電子顕微鏡（TEM）を使用して、Ca2+イオンの存在下でナノディスクへの5LOの結合を可視化することができました。その結果、Ca2+イオンが存在しない場合には、5LOは膜に結合しなかった。本研究では、HisタグがFLAPのC末端ではなくN末端に位置している場合、FLAPはナノディスク中で再構成された。私たちの目的は、1) FLAP が存在する場合にも 5LO が Ca2+依存的に結合するかどうかを調べることでした。2) 基質(AA)は5LOのFLAPナノディスクへの結合に影響を与えるか？5LOとFLAP-ナノディスク間の複合体形成を評価するためにTEMを用い、ショ糖勾配精製、ゲル電気泳動、質量分析を行った。その結果、カルシウムが添加されていない場合には、AAの存在だけで錯体形成が誘導されることがわかった。この結果は、AAが複合体形成に必要であり、5LOの膜へのリクルートには主にCa2+フラッシュが必要であることを裏付けるものである。また、私たちの結果は、FLAPが組み込まれていないナノディスクの場合と同様に、Ca2+イオンの添加がFLAPナノディスク上の5LOの結合を促進することを示した。添加物質がない場合は、5LO-FLAP複合体は形成されませんでした。もう一つの発見は、5LO-FLAP複合体の形成がin vitroで5LOの断片化を誘導するように見えることである。

Among the first steps in inflammation is the conversion of arachidonic acid (AA) stored in the cell membranes into leukotrienes. This occurs mainly in leukocytes and depends on the interaction of two proteins: 5-lipoxygenase (5LO), stored away from the nuclear membranes until use and 5-lipoxygenase activating protein (FLAP), a transmembrane, homotrimeric protein, constitutively present in nuclear membrane. We could earlier visualize the binding of 5LO to nanodiscs in the presence of Ca2+-ions by the use of transmission electron microscopy (TEM) on samples negatively stained by sodium phosphotungstate. In the absence of Ca2+-ions 5LO did not bind to the membrane. In the present communication, FLAP reconstituted in the nanodiscs which could be purified if the His-tag was located on the FLAP C-terminus but not the N-terminus. Our aim was to find out if 1) 5LO would bind in a Ca2+-dependent manner also when FLAP is present? 2) Would the substrate (AA) have effects on 5LO binding to FLAP-nanodiscs? TEM was used to assess the complex formation between 5LO and FLAP-nanodiscs along with, sucrose gradient purification, gel-electrophoresis and mass spectrometry. It was found that presence of AA by itself induces complex formation in the absence of added calcium. This finding corroborates that AA is necessary for the complex formation and that a Ca2+-flush is mainly needed for the recruitment of 5LO to the membrane. Our results also showed that the addition of Ca2+-ions promoted binding of 5LO on the FLAP-nanodiscs as was also the case for nanodiscs without FLAP incorporated. In the absence of added substances no 5LO-FLAP complex was formed. Another finding is that the formation of a 5LO-FLAP complex appears to induce fragmentation of 5LO in vitro.