ヒト血清カルノシナーゼ活性測定のための直接LC-ESI-MS法の開発

Development of a direct LC-ESI-MS method for the measurement of human serum carnosinase activity.

• Ettore Gilardoni
• Silvia Gervasoni
• Marco Maspero
• Clelia Dallanoce
• Giulio Vistoli
• Marina Carini
• Giancarlo Aldini
• Luca Regazzoni

抄録

カルノシン（β-アラニル-L-ヒスチジン）は天然のペプチドであり、ヒトの疾患モデル動物におけるいくつかの薬理試験で良好な結果が得られたことから、潜在的な薬理作用を有する薬剤として記述されてきた。しかしながら、カルノシンは、吸収されたペプチドは、カルノシナーゼ（すなわち、CN1；E.C. 3.4.13.20）という酵素によって血清中で急速に加水分解されるため、ヒトでの活性は限られています。長年にわたり、カルノシンの加水分解を制限することを目的とした主なアプローチは、増加したバイオアベイラビリティおよび未修飾または強化された活性を有するCN1安定な誘導体を得ることに焦点を当ててきた。最近になって、カルノシンとCN1の選択的阻害剤の共同投与の仮説が提案されました。このようなアプローチは、いくつかの化合物から化合物全体のライブラリまでテストすることができるスループットスケールでCN1によって操作されるカルノシン加水分解率に及ぼす影響をスクリーニングするための信頼性の高い方法を必要とします。文献で利用可能なそのような機能を持つ唯一のアッセイは、加水分解生成物（すなわち、ヒスチジン）のオルト-フタルアルデヒド（OPA）誘導体化に依存しており、その後、透視読み取りを行います。ここでは、液体クロマトグラフィー質量分析法（LC-MS）による残留基質の直接測定に基づく代替法を提案します。この方法は、ヒト血清中に決定されたカルノシンの加水分解率に関する文献データと同等の結果が得られたので、信頼性が高いことが実証された。また、この方法は、カルノシンのすべての天然アナログの加水分解率の測定で示されたように、非常に柔軟であり、容易に基質の変化に適応することができました。この文脈では、アンセリンのために収集されたデータは、我々の方法がより信頼性が高く、OPA -ベースのアッセイでは、基質の変化が加水分解活性を過小評価する可能性があることを示唆している。

Carnosine (β-alanyl-L-histidine) is a natural peptide that have been described as a potential pharmacological agent owing to some positive outcomes from several pharmacological tests in animal models of human diseases. However, carnosine has limited activity in humans since the peptide upon absorption is rapidly hydrolyzed in the serum by the enzyme carnosinase (i.e. CN1; E.C. 3.4.13.20). Over the years the main approaches aimed at limiting carnosine hydrolysis have been focused on obtaining CN1-stable derivatives with an increased bioavailability and unmodified or enhanced activity. Only recently the hypothesis of co-administration of carnosine and selective inhibitors of CN1 have been proposed. Such an approach requires reliable methods for screening the effect on carnosine hydrolysis rate operated by CN1 in a throughput scale allowing to test from few compounds up to whole compound libraries. The only assay with such features available in literature relies on ortho-phtalaldehyde (OPA) derivatization of the hydrolysis product (i.e. histidine), followed by a fluorimetric read. Herein, we propose an alternative method based on a direct measurement of the residual substrate by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). The assay demonstrated to be reliable since gave results comparable to literature data concerning the hydrolysis rate of carnosine as determined into human serum. Moreover, the method was quite flexible and easily adaptable to a substrate change, as demonstrated by the measurement of the hydrolysis rate of all the natural analogs of carnosine. In this context the data collected for anserine suggest that our method looked more reliable and substrate change can undergo an underestimation of hydrolytic activity in OPA -based assays.

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