ヒアルロン酸でコーティングされた金ナノロッドは、軟骨再生のためのBMP-2ペプチド送達を強化する

Hyaluronic acid-coated gold nanorods enhancing BMP-2 peptide delivery for chondrogenesis.

• Kanokwan Sansanaphongpricha
• Pacharapan Sonthithai
• Pakkanun Kaewkong
• Boonlom Thavornyutikarn
• Suwussa Bamrungsap
• Wasana Kosorn
• Tapanee Thinbanmai
• Nattika Saengkrit

抄録

骨形態形成タンパク質-2（BMP-2）ナックルエピトープペプチドは、最近発見され、軟骨形成を活性化することが知られています。しかし、この可溶性ペプチドは急速に拡散し、標的細胞への取り込みが悪いため、その応用は非常に限られたものに留まっています。本研究では、チオール化されたBMP-2ナックルエピトープペプチドと共役するために、ヒアルロン酸を機能化した金ナノロッドを用いたナノ粒子を設計しました。ヒアルロン酸は、金ナノロッド（ＧＮＲ）表面のセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）リガンドの代わりにチオール官能基を有するように修飾した。続いて、チオール化したペプチドをマレイミド-ヒドラジド架橋剤を介してGNR表面のヒアルロン酸と反応させた。共役化は、GNRの表面電荷の変化とプラズモンシフトによって確認された。チオール化ペプチドの69%以上がヒアルロン酸で被覆された金ナノロッド（HGR）と共役していることが示唆された。さらに、インビトロでの細胞生存率は、BMP-2と共役したヒアルロン酸機能化金ナノロッド（B2HGR）が細胞適合性を有し、線維芽細胞に細胞毒性を引き起こさないことを示した。また、B2HGRは、ヒト間葉系幹細胞（hMSCs）とブタ軟骨細胞の両方において、細胞表面のBMP受容体に多価のリガンドが結合し、受容体を介したエンドサイトーシスをもたらすことにより、BMP-2ペプチドの細胞内への取り込みを有意に促進することがわかった。その結果、II型コラーゲン遺伝子の発現とグルコサミノグリカン（GAG）の分泌が活性化されたことが共焦点顕微鏡で確認できました。さらに、我々のデリバリーシステムは、軟骨修復を強化するために、ナノデリバリープラットフォームと組み合わせて足場を使用することの概念を実証するものである。また、本研究では、足場材を用いたナノデリバリーシステムを用いることで、軟骨修復能を向上させることができます。したがって、我々のデリバリープラットフォームは、将来的には前臨床および臨床での軟骨再生への応用の可能性を持っています。

Bone morphogenic protein-2 (BMP-2) knuckle epitope peptide has been recently discovered and known to activate chondrogenesis. However, the applications of this soluble peptide remain very limited due to rapid diffusion resulting in poor cellular uptake into target cells. We herein designed nanoparticles made from hyaluronic acid functionalized gold nanorods to conjugate with thiolated BMP-2 knuckle epitope peptide via a two-step reaction. Hyaluronic acid was modified to have thiol functional groups to replace the cetyl trimethylammonium bromide (CTAB) ligands on the surface of gold nanorods (GNRs). The thiolated peptides were subsequently reacted with hyaluronic acid on the surface on GNRs via a maleimide-hydrazide crosslinker. The conjugation was confirmed by the change of surface charge of GNRs and the plasmon shift. A colorimetric peptide assay suggested more than 69 % of the thiolated peptides were conjugated with the hyaluronic acid coated gold nanorods (HGRs). Moreover, in vitro cell viability showed that BMP-2 conjugated hyaluronic acid functionalized gold nanorods (B2HGR) were cytocompatible and did not cause cytotoxicity to fibroblast cells. The B2HGRs also significantly promote cellular uptake of the BMP-2 peptides in both human mesenchymal stem cells (hMSCs) and porcine chondrocytes due to multivalent ligand binding to the BMP receptors on the cell surface resulting in receptor-mediated endocytosis. The enhanced cellular uptake was clearly observed under a confocal microscope resulting in the significant activation of type II collagen gene expression and glucosaminoglycan (GAG) secretion in those cells. Furthermore, our delivery system is a proof-of-concept of using scaffolds in a combination with nanodelivery platform to enhance cartilaginous repair. The peptide loading capacity and the release is not limited by the scaffolds. Therefore, our delivery platform has potential applications for cartilage regeneration in a preclinical and clinical setting in the future.

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