FRET解析により明らかになった不均一二量体タンパク質のドメインドメイン間相互作用に対するカチオンの特異的効果

Cation Specific Effects on the Domain-Domain Interaction of Heterogeneous Dimeric Protein Revealed by FRET Analysis.

• Tomohiro Aoyama
• Akane Kato
• Etsuko Nishimoto

抄録

緑色蛍光タンパク質（GFP）-グルタチオン-トランスフェラーゼ（GST）融合タンパク質をモデルタンパク質として、異種二量体タンパク質のドメイン-ドメイン間相互作用に及ぼす特異的な一価カチオン効果を調べた。GST ドメインの N 末端を蛍光プローブ Cyanine3 と共役させると、GFP の排他的な励起で Cyanine3 と GFP の相補的な蛍光強度の増減が認められ、さらに GFP の蛍光減衰が著しく促進され、GFP-GST ドメイン間に優れたフェルスター型の共鳴励起エネルギー移動（FRET）ペアが構築されることを明らかにした。FRETペアのスペクトルオーバーラップ積分は5.96×10Mcm、臨界距離は62.5Åと推定された。また、エネルギー供与体であるGFPの蛍光寿命で評価したFRET率と効率は、緩衝液に含まれる一価カチオンの影響を受けており、GFP-GST融合タンパク質のドメイン-ドメイン相互作用はカチオン種とその濃度の影響を受けやすいことが示唆された。ドメイン-ドメイン間相互作用に影響を与える順序は、Li>NH>Na>K>Csと推定され、逆ホフマイスター級数にほぼ対応する。

Specific monovalent cation effects on the domain-domain interaction of heterogeneous dimeric protein were investigated using green fluorescent protein (GFP)-glutathione-s-transferase (GST) fusion protein as a model protein. Conjugating N-terminal of GST domain with a fluorescence probe Cyanine3, complementary increase and decrease of fluorescence intensities of Cyanine3 and GFP were recognized on the exclusive excitation of GFP and further the fluorescence decay of GFP was remarkably accelerated to show that an excellent Förster type of resonance excitation energy transfer (FRET) pair was constructed between GFP- and GST-domain. The spectral overlap integral and critical distance of the FRET pair were estimated to be 5.96×10 Mcm and 62.5 Å, respectively. The FRET rate and efficiency evaluated by fluorescence lifetime of the energy donor, GFP, were influenced by the monovalent cations included in the buffer solution to suggest that the domain-domain interactions of GFP-GST fusion protein would be susceptible to cation species and their concentrations. The order affecting the domain-domain interaction was estimated to be Li>NH >Na>K>Cs, almost corresponding to the reverse Hofmeister series.