メラトニンは、ミトコンドリア透過性遷移孔の開口を阻害することで、ラム精子の凍結保存を改善します

Melatonin improves cryopreservation of ram sperm by inhibiting mitochondrial permeability transition pore opening.

• Yi Fang
• Chengzhen Zhao
• Hai Xiang
• GongXue Jia
• Rongzhen Zhong

抄録

冷凍保存は、ミトコンドリア透過性遷移孔（mPTP）の形成とともに、精子のミトコンドリア膜の透過性にダメージを与える。ミトコンドリアはメラトニンの主要な合成部位であり、またメラトニンmの主要な標的でもあり、mPTP形成を直接阻害することができる。目的は、凍結解凍したラム精子のmPTP開孔に対するメラトニンの効果を決定し、メラトニン受容体（MT）のアンタゴニストおよびアゴニスト、PI3KおよびGSK 3βのアンタゴニスト処理により、その根底にある経路を明らかにすることであった。さらに、血漿膜の完全性、ミトコンドリア膜電位（ΔΨm）、ミトコンドリアのチトクロムc（Cytc）の放出および受精を分析し、メラトニンが媒介するmPTP状態が凍結融解した精子の品質に及ぼす影響を評価した。新鮮なラム精液をグルコース卵黄緩衝液中で０または１０Ｍのメラトニンで希釈し（それぞれ凍結群および凍結＋メラトニン群）、徐凍した。凍結解凍した精子において、4℃平衡化開始時に添加したメラトニンは、mPTP開封抑制、シクロフィリンDのペプチジルプロリルシス/トランス異性化酵素活性低下、細胞膜完全性、ΔΨm、ミトコンドリアCyt c濃度、受精能の上昇に最も効果的であった（P＜0.05）。メカニズム研究では、メラトニン受容体(MT)1アンタゴニストはmPTP開通に対するメラトニンの阻害を除去したが、MT1アゴニストは逆の効果を示した(P < 0.05)。MT2アンタゴニストもアゴニストも有意な効果はなかったが、PI3Kおよび/またはGSK 3βアンタゴニストはMT1アゴニストのmPTP開通阻害を減少させた(P < 0.05)。結論として、メラトニンは、おそらくPI3K-Akt-GSK 3β経路を介してMT1に作用してmPTP開通を阻害することで、精子の凍結保存を改善した。

Cryopreservation damages permeability of sperm mitochondrial membranes, with formation of a mitochondrial permeability transition pore (mPTP). Mitochondria are both a primary synthesis site and principle target for melatoninm, and which can directly inhibit mPTP formation. The objective was to determine effects of melatonin on mPTP opening of frozen-thawed ram sperm, and elucidate underlying pathways by antagonist and agonists of melatonin receptors (MTs), and antagonists of PI3K and GSK 3β treatments; furthermore, plasma membrane integrity, mitochondrial membrane potential (ΔΨm), mitochondrial Cytochrome c (Cyt c) release and fertilization were analyzed to assess the effect of mPTP status mediated by melatonin on quality of frozen-thawed sperm. Fresh ram semen was diluted in glucose-egg yolk buffer with 0 or 10 M melatonin (frozen and frozen+melatonin groups, respectively) and slow-frozen. In frozen-thawed sperm, melatonin added at initiation of 4°C equilibration was most effective for inhibiting mPTP opening, decreasing peptidyl-prolyl-cis/trans isomerase activity of Cyclophilin D and increasing plasma membrane integrity, ΔΨm, mitochondrial Cyt c concentration and fertilizing ability (P < 0.05). In a mechanistic study, the melatonin receptor (MT)1 antagonist eliminated inhibition of melatonin on mPTP opening, whereas MT1 agonist had opposite effects (P < 0.05). Neither MT2 antagonist nor agonist had significant effect, but PI3K and/or GSK 3β antagonist decreased inhibition of MT1 agonist on mPTP opening (P < 0.05). In conclusion, melatonin improved sperm cryopreservation, perhaps by acting on MT1 via the PI3K-Akt-GSK 3β pathway to inhibit mPTP opening.

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