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ダブルクエンチャープローブを用いた逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）法における重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）の検出感度向上について
Double-quencher probes improve detection sensitivity toward Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) in a reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) assay.
PMID: 32650037 DOI: 10.1016/j.jviromet.2020.113926.
抄録
背景:
中国湖北省武漢市で発生した重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）は世界中に広がり、人命を脅かしています。SARS-CoV-2の検出は、新たな発生を防ぎ、病気の拡大を抑制し、患者の管理を行う上で非常に重要である。現在、臨床検査室では逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）法を用いてウイルスを検出しています。しかし、この検査法は特異性が高いとされていますが、感度は60～70％と低いと報告されています。そのため、感度の向上が急務となっている。
BACKGROUND: Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) which emerged in the city of Wuhan, Hubei Province, China, has spread worldwide and is threatening human life. The detection of SARS-CoV-2 is critical for preventing new outbreaks, curbing disease spread, and managing patients. Currently, a reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) assay is used to detect the virus in clinical laboratories. However, although this assay is considered to have high specificity, its sensitivity is reportedly as low as 60-70%. Improved sensitivity is, therefore, urgently required.
方法:
我々は、米国CDCが推奨するプライマーとシングルクエンチャープローブ（N1、N2、N3）、日本のNIIDが推奨するプライマー（N1、N2）を使用した。さらに、NIIDから提供されたウイルス配列に従ってダブルクエンチャープローブを設計し、さらなるアッセイ（YCHアッセイ[N1およびN2]と呼ばれる）を開発した。これらのアッセイを用いて、我々は、3つのアッセイの検出感度を評価し、比較するために、連続的に希釈したDNA陽性対照を用いてRT-PCRを実施した。さらに、診断性能を決定するために66本の鼻咽頭スワブを試験した。
METHODS: We used the primers and single-quencher probes recommended by the CDC (N1, N2 and N3) in the USA and the NIID (N1 and N2) in Japan. In addition, we designed double-quencher probes according to the virus sequence provided by the NIID to develop a further assay (termed the YCH assay [N1 and N2]). Using these assays, we conducted RT-PCR with serially diluted DNA positive controls to assess and compare the detection sensitivity of the three assays. Furthermore, 66 nasopharyngeal swabs were tested to determine the diagnostic performances.
結果:
RT-PCRのしきい値サイクル（Ct）値は、CDCとYCHアッセイではNIIDアッセイに比べて比較的低かった。シリアル希釈アッセイは、CDCおよびYCHアッセイの両方が、DNA陽性コントロールの低いコピー数を検出できることを示した。ベースラインでのバックグラウンド蛍光シグナルは、YCHアッセイの方がNIIDアッセイに比べて低かった。66本の鼻咽頭スワブを用いて、シングル（NIID）プローブとダブルクエンチャー（YCH）プローブの間の診断性能を評価した。YCH-N2アッセイの結果を参考にした場合，NIID-N1では56％，YCH-N1では61％，NIID-N2では94％の正の一致率でSARS-CoV-2を検出し，NIID-N1，YCH-N1，NIID-N2では100％の負の一致率でSARS-CoV-2を検出した．
RESULTS: The threshold cycle (Ct) value of the RT-PCR was relatively low for the CDC and YCH assays compared with the NIID assay. Serial dilution assays showed that both the CDC and YCH assays could detect low copy numbers of the DNA positive control. The background fluorescence signal at the baseline was lower for the YCH assay compared with the NIID assay. We assessed the diagnostic performance between single- (NIID) and double-quencher (YCH) probes using 66 nasopharyngeal swabs. When the results of YCH-N2 assay were used as a reference, each assay detected SARS-CoV-2 with positive percent agreements of 56% for NIID-N1, 61% for YCH-N1, and 94% for NIID-N2, and 100% negative percent agreements for NIID-N1, YCH-N1 and NIID-N2.
結論:
ダブルクエンチャープローブはバックグラウンド蛍光を減少させ、SARS-CoV-2のRT-PCRの検出感度を向上させた。
CONCLUSION: Double-quencher probes decreased the background fluorescence and improved the detection sensitivity of RT-PCR for SARS-CoV-2.
Copyright © 2020. Published by Elsevier B.V.