原生動物由来の融合TvG6PD::6PGLタンパク質の特徴と酵素の安定性に及ぼすNADP分子の影響

Characterizing the Fused TvG6PD::6PGL Protein from the Protozoan , and Effects of the NADP Molecule on Enzyme Stability.

• Laura Morales-Luna
• Beatriz Hernández-Ochoa
• Edson Jiovany Ramírez-Nava
• Víctor Martínez-Rosas
• Paulina Ortiz-Ramírez
• Fabiola Fernández-Rosario
• Abigail González-Valdez
• Noemí Cárdenas-Rodríguez
• Hugo Serrano-Posada
• Sara Centeno-Leija
• Roberto Arreguin-Espinosa
• Miguel Cuevas-Cruz
• Daniel Ortega-Cuellar
• Verónica Pérez de la Cruz
• Luz María Rocha-Ramírez
• Edgar Sierra-Palacios
• Rosa Angélica Castillo-Rodríguez
• Vanesa Vega-García
• Yadira Rufino-González
• Jaime Marcial-Quino
• Saúl Gómez-Manzo

抄録

本報告は、原生動物（）由来のグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼデヒドロゲナーゼ-ホスホグルコノラクトナーゼ蛋白質の融合体の機能解析と構造解析について述べたものである。のグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ()遺伝子をPCRにより単離し、その配列を調べたところ、遺伝子と融合していることがわかった。融合したTv::遺伝子をクローニングし、異種系で過剰発現させた。組換えタンパク質をアフィニティークロマトグラフィーで精製したところ、TvG6PD::6PGLタンパク質のオリゴマー状態は四量体であり、最適pHは8.0であった。グルコース-６-リン酸（Ｇ６Ｐ）およびニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を基質として、Ｇ６ＰＤドメインのキネティックパラメータを決定した。NADPの存在下でも非存在下でもタンパク質の安定性に及ぼす温度の影響、トリプシン消化に対する感受性、グアニジン塩酸塩の分析などの生化学的アッセイを行った。その結果、NADPの存在下ではタンパク質がより安定になることが明らかになった。さらに、タンパク質中のNADPの結合定数（）を決定し、融合したTvG6PD::6PGLタンパク質の構造部位の可能性を示唆した。最後に、TvG6PD::6PGLの構造の近似値を得るために、計算モデル化研究を行った。生成されたモデルは、両方が融合しているにもかかわらず、GlG6PD::6PGLタンパク質との違いを示した（ヒトG6PDとの違いはさらに大きい）。

This report describes a functional and structural analysis of fused glucose-6-phosphate dehydrogenase dehydrogenase-phosphogluconolactonase protein from the protozoan (). The glucose-6-phosphate dehydrogenase () gene from . was isolated by PCR and the sequence of the product showed that is fused with gene. The fused Tv:: gene was cloned and overexpressed in a heterologous system. The recombinant protein was purified by affinity chromatography, and the oligomeric state of the TvG6PD::6PGL protein was found as tetramer, with an optimal pH of 8.0. The kinetic parameters for the G6PD domain were determined using glucose-6-phosphate (G6P) and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP) as substrates. Biochemical assays as the effects of temperature, susceptibility to trypsin digestion, and analysis of hydrochloride of guanidine on protein stability in the presence or absence of NADP were performed. These results revealed that the protein becomes more stable in the presence of the NADP. In addition, we determined the dissociation constant for the binding () of NADP in the protein and suggests the possible structural site in the fused TvG6PD::6PGL protein. Finally, computational modeling studies were performed to obtain an approximation of the structure of TvG6PD::6PGL. The generated model showed differences with the GlG6PD::6PGL protein (even more so with human G6PD) despite both being fused.