相分離（OOPS）を用いたRNA結合型プロテオームとタンパク質結合型トランスクリプトームの効率的な回収

Efficient recovery of the RNA-bound proteome and protein-bound transcriptome using phase separation (OOPS).

• Eneko Villanueva
• Tom Smith
• Rayner M L Queiroz
• Mie Monti
• Mariavittoria Pizzinga
• Mohamed Elzek
• Veronica Dezi
• Robert F Harvey
• Manasa Ramakrishna
• Anne E Willis
• Kathryn S Lilley

抄録

RNA-タンパク質相互作用は細胞のホメオスタシスや疾患において極めて重要な役割を果たしていますが、現在のアプローチでは、かなりの量の出発物質を必要としたり、RNA種のサブセットのみを回収したり、複雑で時間のかかる研究が行われています。私たちは最近、直交有機相分離法（OOPS）を開発しました。これは、架橋されたRNA-タンパク質付加体を不偏な方法で精製するための、迅速で効率的かつ再現性の高い方法です。OOPSは、分子タギングやポリアデニル化RNAの捕捉を回避します。その代わりに、標準的な TRIzol 抽出液の界面をサンプリングして、RNA 結合タンパク質 (RBPs) とそのコグニレート結合 RNA を濃縮することに基づいています。OOPS特異性は、濃縮された界面をRNaseまたはプロテアーゼで消化して、それぞれRBPまたはタンパク質結合RNAを放出することによって達成されます。ここでは、同じサンプルからタンパク質-RNA付加体、遊離タンパク質および遊離RNAを精製するためのステップバイステップのプロトコルを提示します。さらに、ヒト細胞株、Arabidopsis thaliana、Schizosaccharomyces pombe、Escherichia coliでのOOPSの適用方法と、RBPのダイナミクスを研究するためにどのように使用することができるかについて説明します。

RNA-protein interactions play a pivotal role in cell homeostasis and disease, but current approaches to study them require a considerable amount of starting material, favor the recovery of only a subset of RNA species or are complex and time-consuming. We recently developed orthogonal organic phase separation (OOPS): a quick, efficient and reproducible method to purify cross-linked RNA-protein adducts in an unbiased way. OOPS avoids molecular tagging or the capture of polyadenylated RNA. Instead, it is based on sampling the interface of a standard TRIzol extraction to enrich RNA-binding proteins (RBPs) and their cognate bound RNA. OOPS specificity is achieved by digesting the enriched interfaces with RNases or proteases to release the RBPs or protein-bound RNA, respectively. Here we present a step-by-step protocol to purify protein-RNA adducts, free protein and free RNA from the same sample. We further describe how OOPS can be applied in human cell lines, Arabidopsis thaliana, Schizosaccharomyces pombe and Escherichia coli and how it can be used to study RBP dynamics.