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単一DNA分子イメージングを用いた電離放射線とハイパーサーミアによって誘発されるDNA損傷の定量化
Quantifying DNA damage induced by ionizing radiation and hyperthermia using single DNA molecule imaging.
PMID: 32652469 PMCID: PMC7350159. DOI: 10.1016/j.tranon.2020.100822.
抄録
電離放射線（IR）は癌治療の一般的なモードであり、DNA損傷は細胞死の主な原因である。ここでは、放射線を照射されたリンパ球から単離された単一損傷DNA分子の蛍光イメージングに基づいたアッセイを用いて、IRによって誘発されたDNA損傷を定量化する。このアッセイでは、DNA損傷を認識して除去するDNA修復酵素のカクテルを使用し、ポリメラーゼとリガーゼが損傷部位に蛍光ヌクレオチドを取り込み、各部位の蛍光スポットを生成する。これにより、個々の蛍光スポットを一本のDNA分子に沿ってカウントすることができ、DNA損傷の全体的なレベルを定量することができる。我々の結果は、酵素カクテルにヒトアピュリン/アピリミジン酸エンドヌクレアーゼ1（APE1）を含めることで、IR誘発損傷の検出のためのアッセイの感度が大幅に向上することを実証している。この最適化されたアッセイはまた、IR治療においてアジュバントとして使用されることがある軽度の温熱療法とIRを組み合わせた場合に、DNA損傷の協調的な増加を検出することができた。最後に、IRや他のタイプのDNA損傷剤に敏感な患者を識別するために、この方法がどのように使用され得るかについて議論する。
Ionizing radiation (IR) is a common mode of cancer therapy, where DNA damage is the major reason of cell death. Here, we use an assay based on fluorescence imaging of single damaged DNA molecules isolated from radiated lymphocytes, to quantify IR induced DNA damage. The assay uses a cocktail of DNA-repair enzymes that recognizes and excises DNA lesions and then a polymerase and a ligase incorporate fluorescent nucleotides at the damage sites, resulting in a fluorescent "spot" at each site. The individual fluorescent spots can then be counted along single stretched DNA molecules and the global level of DNA damage can be quantified. Our results demonstrate that inclusion of the human apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 (APE1) in the enzyme cocktail increases the sensitivity of the assay for detection of IR induced damage significantly. This optimized assay also allowed detection of a cooperative increase in DNA damage when IR was combined with mild hyperthermia, which is sometimes used as an adjuvant in IR therapy. Finally, we discuss how the method may be used to identify patients that are sensitive to IR and other types of DNA damaging agents.
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