Photorhabdus昆虫関連毒素、Vibrio spp.から放出されるPirAおよびPirBに対するモノクローナル抗体を用いた間接的酵素連鎖免疫測定法（iELISA）の開発

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J. Microbiol. Methods.2020 Jul;:106002. S0167-7012(20)30477-2. doi: 10.1016/j.mimet.2020.106002.Epub 2020-07-09.

Photorhabdus昆虫関連毒素、Vibrio spp.から放出されるPirAおよびPirBに対するモノクローナル抗体を用いた間接的酵素連鎖免疫測定法（iELISA）の開発

Development of an indirect Enzyme Linked Immunoassay (iELISA) using monoclonal antibodies against Photorhabdus insect related toxins, PirA and PirB released from Vibrio spp.

Hung Nam Mai
Roberto Cruz-Flores
Arun K Dhar

PMID: 32653400 DOI: 10.1016/j.mimet.2020.106002.

抄録

急性肝膵壊死症（AHPND）は、世界のエビ産業に深刻な損失をもたらしています。AHPNDの病因は、二元毒素であるPirABをコードする大型プラスミドを保有するビブリオ菌で、現在、PCR法を用いてPirABの有無を検出する方法で診断されています。現在、AHPNDの診断にはPCR法が用いられており、PirA遺伝子とPirB遺伝子の両方の存在を検出しています。しかし、pirAおよびpirB遺伝子を含む細菌株は必ずしも二元毒素を発現しているとは限らず、その結果、pirAおよびpirB遺伝子を含む細菌株の病原性を誤って評価してしまうことになる。したがって、免疫学的アッセイ（すなわちＥＬＩＳＡ）は、ＰｉｒＡおよびＰｉｒＢを検出するための有望なアプローチである。本研究では、PirA（20 mAb）およびPirB（20 mAb）に対する合計40個のモノクローナル抗体クローン（mAb）をウエスタンブロット分析によりスクリーニングし、間接ELISA（iELISA）で最も強い免疫反応性を示す4個のmAbクローンを選択した。選定した4つのmAb（PirAに対する1B9および5E9、PirBに対する7B7および7B9）は、AHPNDの原因菌であるビブリオ菌を特異的に検出した。さらに、4種類のmAbsは0.008ng/μlまでPirAまたはPirBを検出することができた。AHPNDに感染した30匹のAHPND感染エビと6匹のSPFエビPenaeus vannameiを用いた二重盲検アッセイをiELISAで解析し、アッセイの検出感度を決定した。その結果、30匹のAHPND感染エビのうち29匹を正確に検出できた。これらの結果から、iELISAは感染エビのPirAおよびPirB毒素を検出するための信頼性の高い方法であり、AHPNDの診断やAHPNDの発症における二元毒素の役割を研究する上で有用なツールとなることが示された。

An acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) causes serious losses to the global shrimp industry. The etiologic agent of AHPND is Vibrio spp. carrying a large plasmid which encodes a binary toxin, PirAB. Currently, AHPND is diagnosed by PCR based methods that detect the presences of both pirA and pirB genes. However, the bacterial strains containing the pirA and pirB genes do not always express the binary toxin, resulting in mis-estimation of the virulence of bacterial strains containing pirA and pirB genes. Thus, the immuno based assay (i.e. ELISA) is a promising approach to detect PirA and PirB. In the present study, a total of forty monoclonal antibodies clones (mAb) against PirA (20 mAbs) and PirB (20 mAbs) were screened by western blot analysis to select four mAb clones that show the strongest immunoreactivity in indirect ELISA (iELISA). The four selected mAbs (i.e. 1B9 and 5E9 against PirA; 7B7 and 7B9 against PirB) detected specifically Vibrio spp. causing AHPND. In addition, four selected mAbs were able to detect either PirA or PirB down to 0.008 ng/μl. A double blind assay using thirty AHPND-infected and six SPF shrimp Penaeus vannamei were analyzed by iELISA to determine the detection sensitivity of the assay. The results showed that iELISA was able to accurately detect 29 out of 30 AHPND infected shrimp. These finding indicated that iELISA is a reliable method to detect PirA and PirB toxins in infected shrimp and will be a useful tool in AHPND diagnosis and in studying the role of binary toxins in AHPND pathogenesis.