エストロゲン欠乏症における骨芽細胞と骨細胞のミネラル化とプロステオブラストの副次的シグナル伝達の変化を明らかにする新しい3次元骨芽細胞・骨細胞モデルの開発

A Novel 3D Osteoblast and Osteocyte Model Revealing Changes in Mineralization and Pro-osteoclastogenic Paracrine Signaling During Estrogen Deficiency.

• Syeda Masooma Naqvi
• Juan Alberto Panadero Pérez
• Vatsal Kumar
• Anneke S K Verbruggen
• Laoise M McNamara

抄録

近年の研究により、エストロゲン欠乏時には骨芽細胞と骨細胞の力学的応答が根本的に損なわれることが明らかになってきました。しかし、これらの二次元（二次元）細胞培養研究は、生物物理的な手がかりを考慮していません。そこで、本研究の目的は、（1）バイオリアクターに統合された骨芽細胞と破骨細胞の3次元（3D）モデルを開発し、（2）このモデルを用いて、エストロゲン欠乏が破骨細胞による骨吸収に関連する骨芽細胞から破骨細胞への移行、メカノセンス、ミネラル化、パラクリンシグナル伝達の変化につながるかどうかを検討することである。MC3T3-E1sをエストロゲン（17β-エストラジオール）を補充した培地で培養した。これらの細胞は、（1）継続的なエストロゲン（E）または（2）それ以上のエストロゲン補充なしで培養する前にゼラチン-mtgaseでカプセル化した。コンストラクトをガス透過性および水不透過性の細胞培養バッグに入れ、5％COおよび37℃で維持した。これらのバッグは、カスタム静水圧（HP）バイオリアクターで機械的に刺激するか、静的条件（コントロール）で維持した。我々は、樹状突起の存在と破骨細胞マーカーである象牙質マトリックス酸性ホスホプロテイン1（DMP1）の染色によって特徴づけられる破骨細胞の分化が、エストロゲン休薬（EW）下では、継続的なエストロゲン治療下（21日目）と比較して有意に大きかったことを報告している。また、エストロゲン欠乏細胞と機械的刺激を受けた細胞では、ミネラル化［骨シアルプロテイン()、オステオポンチン()、アルカリホスファターゼ(ALP)、カルシウム］と破骨細胞形成のためのパラクリンシグナルに関連する遺伝子発現［核因子κ-βリガンドの受容体活性化因子()/オステオプロテゲゲリン比］が有意に増加していました。興味深いことに、BSPは1日目に、DMP-1は21日目にそれぞれ増加しており、バイオミネラリゼーションの調節に関与していることがわかった。さらに、プロosteoclastogenic signalingの増加は、EW中の骨芽細胞または破骨細胞の力学的応答性の変化によって説明される可能性があります。これらの知見は、エストロゲン欠乏が骨細胞機能に与える影響を強調し、エストロゲン欠乏後の骨細胞の変化を支えるメカニズムを調べるための新しいモデルを提供します。

Recent studies have revealed that the mechanobiological responses of osteoblasts and osteocytes are fundamentally impaired during estrogen deficiency. However, these two-dimensional (2D) cell culture studies do not account for biophysical cues. Thus, the objectives of this study are to (1) develop a three-dimensional (3D) osteoblast and osteocyte model integrated into a bioreactor and (2) apply this model to investigate whether estrogen deficiency leads to changes in osteoblast to osteocyte transition, mechanosensation, mineralization, and paracrine signaling associated with bone resorption by osteoclasts. MC3T3-E1s were expanded in media supplemented with estrogen (17β-estradiol). These cells were encapsulated in gelatin-mtgase before culture in (1) continued estrogen (E) or (2) no further estrogen supplementation. Constructs were placed in gas permeable and water impermeable cell culture bags and maintained at 5% CO and 37°C. These bags were either mechanically stimulated in a custom hydrostatic pressure (HP) bioreactor or maintained under static conditions (control). We report that osteocyte differentiation, characterized by the presence of dendrites and staining for osteocyte marker dentin matrix acidic phosphoprotein 1 (DMP1), was significantly greater under estrogen withdrawal (EW) compared to under continuous estrogen treatment (day 21). Mineralization [bone sialoprotein (), osteopontin (), alkaline phosphatase (ALP), calcium] and gene expression associated with paracrine signaling for osteoclastogenesis [receptor activator of nuclear factor kappa-β ligand ()/osteoprotegerin ratio] were significantly increased in estrogen deficient and mechanically stimulated cells. Interestingly, BSP and DMP-1 were also increased at day 1 and day 21, respectively, which play a role in regulation of biomineralization. Furthermore, the increase in pro-osteoclastogenic signaling may be explained by altered mechanoresponsiveness of osteoblasts or osteocytes during EW. These findings highlight the impact of estrogen deficiency on bone cell function and provide a novel model to investigate the mechanisms underpinning changes in bone cells after estrogen deficiency.

Copyright © 2020 Naqvi, Panadero Pérez, Kumar, Verbruggen and McNamara.