デュアル蛍光レポーターの使用による生きた癌細胞内のGLUT1トラフィッキングの可視化

Visualization of GLUT1 Trafficking in Live Cancer Cells by the Use of a Dual-Fluorescence Reporter.

• Zhen-Yan Li
• Yu-Ling Shi
• Guo-Xiong Liang
• Jie Yang
• Song-Kuan Zhuang
• Jie-Bin Lin
• Abdelmoumin Ghodbane
• Man-Seng Tam
• Zu-Jian Liang
• Zhen-Gang Zha
• Huan-Tian Zhang

抄録

グルコース代謝は、正常な細胞代謝および異常な細胞代謝の両方において、エネルギー生産および細胞生存のために不可欠なプロセスである。グルコーストランスポーター1（GLUT1）を含むいくつかのグルコーストランスポーター/溶質キャリア2A（GLUT/SLC2A）スーパーファミリーのメンバーは、様々な細胞タイプでグルコースの細胞取り込みを媒介することが示されています。GLUT1が媒介するグルコース取り込みは一過性で迅速なプロセスであるため、GLUT1の発現とGLUT1依存性グルコース取り込みの理解を深めるためには、GLUT1トラフィッキングをリアルタイムでモニタリングすることが極めて重要である。本研究では、mCherry-EGFP-GLUT1 タンデム蛍光トレーシングシステムを用いて、生細胞の細胞膜とエンドリソソソーム系の間のGLUT1のトラフィッキングを迅速かつ効果的に可視化する方法を確立した。PMに局在するGLUT1は、赤色（mCherry）と緑色（EGFP）の両方の蛍光を示すことがわかった（重なり合うと黄色）。しかし、グルコース遮断時には、赤色のパンクテート蛍光（mCherryは酸性pHに耐性がある）は有意に増加したが、緑色の蛍光（EGFPは酸性pHで消光する）は増加しなかったことから、mCherry-EGFP-GLUT1機能タンパク質が酸性エンドリソソーム系に輸送されていることが示唆された。また、転座係数を定量化することで、mCherryとEGFPの相対的な比率を計算することができ、GLUT1の内部化とその後のリソソソーム分解の指標となることがわかった。ｍＣｈｅｒｒｙ-ＥＧＦＰ-ＧＬＵＴ１-Ｓ２２６ＤおよびｍＣｈｅｒｒｙ-ＥＧＦＰ-ＧＬＵＴ１-ΔＣ４の２つの変異体も構築され、ＧＬＵＴ１の輸送を監視するためのｍＣｈｅｒｒｙ-ＥＧＦＰ-ＧＬＵＴ１の特異性が間接的に確認された。一連のエンドソームマーカー（Rab5、Rab7、Rab11）とリソソームマーカーを用いて、GLUT1のトラフィッキングのモデルを定義することができました。さらに、我々の概念実証研究では、pmCherry-EGFP-GLUT1トレースシステムは、低分子アンドログラフォリドによる処理に応答して、GLUT1の内因性変化を正確に反映できることが示された。GLUT1 発現および GLUT1 依存性のグルコース代謝を標的とすることは、多様なタイプの癌および他の特定のグルコース依存性疾患に対する有望な治療戦略であるので、ここでの我々の研究は、pmCherry-EGFP-GLUT1 が GLUT1 依存性の機能研究および潜在的な低分子スクリーニングのためのバイオセンサーとして利用できることを示しています。

Glucose metabolism is an essential process for energy production and cell survival for both normal and abnormal cellular metabolism. Several glucose transporter/solute carrier 2A (GLUT/SLC2A) superfamily members, including glucose transporter 1 (GLUT1), have been shown to mediate the cellular uptake of glucose in diverse cell types. GLUT1-mediated glucose uptake is a transient and rapid process; thus, the real-time monitoring of GLUT1 trafficking is pivotal for a better understanding of GLUT1 expression and GLUT1-dependent glucose uptake. In the present study, we established a rapid and effective method to visualize the trafficking of GLUT1 between the plasma membrane (PM) and endolysosomal system in live cells using an mCherry-EGFP-GLUT1 tandem fluorescence tracing system. We found that GLUT1 localized at the PM exhibited both red (mCherry) and green (EGFP) fluorescence (yellow when overlapping). However, a significant increase in red punctate fluorescence (mCherry is resistant to acidic pH), but not green fluorescence (EGFP is quenched by acidic pH), was observed upon glucose deprivation, indicating that the mCherry-EGFP-GLUT1 functional protein was trafficked to the acidic endolysosomal system. Besides, we were able to calculate the relative ratio of mCherry to EGFP by quantification of the translocation coefficient, which can be used as a readout for GLUT1 internalization and subsequent lysosomal degradation. Two mutants, mCherry-EGFP-GLUT1-S226D and mCherry-EGFP-GLUT1-ΔC4, were also constructed, which indirectly confirmed the specificity of mCherry-EGFP-GLUT1 for monitoring GLUT1 trafficking. By using a series of endosomal (Rab5, Rab7, and Rab11) and lysosomal markers, we were able to define a model of GLUT1 trafficking in live cells in which upon glucose deprivation, GLUT1 dissociates from the PM and experiences a pH gradient from 6.8-6.1 in the early endosomes to 6.0-4.8 in the late endosomes and finally pH 4.5 in lysosomes, which is appropriate for degradation. In addition, our proof-of-concept study indicated that the pmCherry-EGFP-GLUT1 tracing system can accurately reflect endogenous changes in GLUT1 in response to treatment with the small molecule, andrographolide. Since targeting GLUT1 expression and GLUT1-dependent glucose metabolism is a promising therapeutic strategy for diverse types of cancers and certain other glucose addiction diseases, our study herein indicates that pmCherry-EGFP-GLUT1 can be utilized as a biosensor for GLUT1-dependent functional studies and potential small molecule screening.

Copyright © 2020 American Chemical Society.