メチル化パノラマ表示が可能なカーボンドット修飾液状剥離グラフェン電界効果トランジスタを用いた臨床メチル化マルチプローブアッセイ

Multiprobe Assay for Clinical Methylation Based on the Carbon Dot-Modified Liquid-Exfoliated Graphene Field Effect Transistor with a Potential to Present a Methylation Panorama.

• Dong Dong
• Jizhao Zhang
• Runshi Zhang
• Fang Li
• Yueguo Li
• Yunfang Jia

抄録

大腸がん（CRC）の発症には、遺伝子のプロモーター領域のハイパーメチル化が関係している。CRCの早期診断やスクリーニングにおける臨床的意義は実証されているが、従来のDNAメチル化（DNAm）検出では面倒な操作がその普及の妨げとなっていた。ここでは、カーボンドット修飾液体剥離グラフェン電界効果トランジスタ（CD-LEG-FET）をDNAmセンサーとして用い、遺伝子を捕捉するための専用プローブと、アンカーされた配列上の5-メチルシトシン（5mC）位置を認識するための免疫学的認識を用いて、CRC患者のメチル化を判定する電子的方法を提案しています。まず、UV-vis,ラマン,原子間力顕微鏡,フーリエ変換赤外分光法,X線光電子分光法,電子測定などの特性評価を行い、作製した材料やデバイスの同定とナノモルフォロジーを明らかにした。次に、CD-LEG-FETのDNAm感度を向上させるためのCDの役割を、CDを含まないLEG-FETと比較することで明らかにした。第三に、CD-LEG-FET上に捕捉された遺伝子を異なるプローブで評価し、目的のssDNA配列をハイブリダイズするための最適な温度を48℃と決定した。さらに、少量のDNAサンプルに対する検出感度は2 ngと低いことが示された。最後に、提案した電気法とメタライトアッセイを並行して行い、腫瘍とそれに対応する非癌組織のDNAサンプルのメチル化度を調べた。電気的アッセイの診断価値は、受信機動作特性曲線を用いて確認されており、一方で、CD-LEG-FETプラットフォームの優位性は、標的遺伝子のメチル化パノラマを提示することであることが判明した。

The hypermethylation in the promoter region of the gene is associated with the development of colorectal cancer (CRC). Although its clinical significance for early diagnosis and screening of CRC has been demonstrated, the tedious operations in the conventional DNA methylation (DNAm) detection hinder its wide application. Herein, an electronic method for determining methylation in CRC patients is proposed by using the carbon dot-modified liquid exfoliated graphene field effect transistor (CDs-LEG-FET) as the DNAm sensor, the specifically designed probes to capture the gene and the immunologic recognition to recognize 5-methylcytosine (5mC) positions on the anchored sequences. The identification and nanomorphology of the as-prepared materials and devices are executed first by the characterizations of UV-vis, Raman, atomic force microscopy, Fourier transform infrared spectroscopy, X-ray photoelectron spectroscopy, and electronic measurements. Then, the role of CDs in enhancing DNAm sensitivity of CD-LEG-FET is manifested by comparing it with that of CD-free LEG-FET. Third, the captured genes on CD-LEG-FETs by different probes are evaluated, and the optimized temperature for hybridizing the target ssDNA sequences is determined to be 48 °C. Furthermore, the detection sensitivity for the low-quantity of DNA samples is demonstrated to be as low as 2 ng. Finally, the methylation degree of the tumor and corresponding noncancerous tissue DNA samples were examined by the proposed electric method and methylight assay in parallel. The diagnostic value of the electrical assay is confirmed by using the receiver operating characteristic curves; meanwhile, the superiority of the CD-LEG-FET platform is found to present a methylation panorama of the target gene.

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