リアルタイムPCR高分解能融解解析によるCandida分離株の分子同定とCandida種の遺伝的多様性の検討を行った

Molecular identification of Candida isolates by Real-time PCR-high-resolution melting analysis and investigation of the genetic diversity of Candida species.

• Esmaeel Eghtedar Nejad
• Pooya Ghasemi Nejad Almani
• Mohammad Ali Mohammadi
• Samira Salari

抄録

背景:

カンジダ種は最も重要な日和見真菌症の原因の一つと考えられている。カンジダ属の中でも抗真菌薬感受性のパターンが異なるため、正確な同定が重要であり、適切な同定は予防・治療のための抗真菌薬の選択に役立つと考えられている。臨床微生物検査室で広く用いられているカンジダ菌の同定法である表現型法にはいくつかの限界がある。リアルタイムPCR法と高分解能融解分析法（HRMA）は、病原性真菌を迅速に同定するための新しいアプローチである。分子系統学は、カンジダ属の進化をよりよく理解し、カンジダ種の相対的な程度を同定するために不可欠である。本研究の目的は、リアルタイムPCR高分解能融解解析によるCandida単離株の分子同定とCandida種の遺伝的多様性の調査であった。

BACKGROUND: Candida species are considered as the cause of one of the most important opportunistic fungal diseases. Accurate identification of Candida species is important because of antifungal susceptibility patterns are different among these species, so proper identification helps in the selection of antifungal drugs for the prevention and treatment. Phenotypic methods for identification of Candida species, which are widely used in clinical microbiology laboratories, have some limitations. Real-time PCR followed by the high-resolution melting analysis (HRMA) is a novel approach for the rapid recognition of pathogenic fungi. Molecular phylogeny is essential for obtaining a better understanding of the evolution of the genus Candida and the identification of the relative degree of the Candida species. The purpose of this study was molecular identification of Candida isolates by Real-time PCR-high-resolution melting analysis and investigation of the genetic diversity of Candida species.

方法:

HIV/AIDS患者96名から得られたCandidaisolate 111株と非HIV患者98名から得られたCandidaisolate 121株をリアルタイムPCRおよび高分解能融解曲線解析により同定した。カンジダ種間の遺伝的多様性と関連性を評価するために、各種の代表として臨床的に分離された9つのカンジダ株のPCR産物を無作為に選択し、DNA配列解析を行った。

METHODS: Two hundred and thirty-two Candida isolates including 111 Candida isolates obtained from 96 HIV/AIDS patients and 121 Candida isolates obtained from 98 non-HIV persons were identified by real-time PCR and high-resolution melting curve analysis. To evaluate genetic diversity and relationships among Candida species, PCR products of nine clinical Candida isolates, as a representative of each kind of species, were randomly selected for DNA sequence analysis.

結果:

HIV/AIDS患者において、以下の6種のCandida spp.を同定した。C albicans（n=64，57.7％），C glabrata（n=31，27.92％），C parapsilosis（n=9，8.1％），C tropicalis（n=4，3.6％），C krusei（n=2，1.8％），C kefyr（n=1，0.90％）の6種が同定された．非HIV感染者では、C albicans（n=46、38.33％）、C glabrata、C krusei（それぞれn=18、15％）、C tropicalis（n=13、10.83％）、C lusitaniae（n=12、5.17％）、C parapsilosis（n=10、4.31％）、C kefyr、C guillermondii（それぞれn=2、1.66％）の8種が確認された。また、系統解析の結果、2つの主要なクラッドと6つの別個のサブクラッドが存在することが判明した。その結果，分離株の約88.9％がクラッドIに，11.10％がクラッドIIに位置していた。

RESULTS: In HIV/AIDS patients, six species of Candida spp. were identified as follows: C albicans (n = 64; 57.7%), C glabrata (n = 31; 27.92%), C parapsilosis (n = 9; 8.1%), C tropicalis (n = 4; 3.6%), C krusei (n = 2; 1.8%), and C kefyr (n = 1; 0.90%). In non-HIV persons, we identified eight species of Candida including C albicans (n = 46; 38.33%) followed by C glabrata and C krusei (each one, n = 18; 15%), C tropicalis (n = 13; 10.83%), C lusitaniae (n = 12; 5.17%), C parapsilosis (n = 10; 4.31%), and C kefyr and C guillermondii (each one, n = 2; 1.66%). Also, the phylogenetic analysis showed the presence of two main clades and six separate subclades. Accordingly, about 88.9% of the isolates were located in clade I and 11.10% of the studied isolates were in clade II.

結論:

リアルタイムPCRと高分解能融解分析（HRMA）は、特に臨床サンプルにおけるカンジダ種の検出と正確な同定のための、信頼性が高く、迅速かつ簡単なアプローチとして知られています。

CONCLUSIONS: Real-time PCR followed by high-resolution melting analysis (HRMA) is known as a reliable, fast, and simple approach for detection and accurate identification of Candida species, especially in clinical samples.

© 2020 The Authors. Journal of Clinical Laboratory Analysis Published by Wiley Periodicals LLC.