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NaClコトランスポーター遺伝子によって駆動される新規な遠位凸状尿細管特異的Cre-recombinase
A novel distal convoluted tubule-specific Cre-recombinase driven by the NaCl cotransporter gene.
PMID: 32657158 DOI: 10.1152/ajprenal.00101.2020.
抄録
Cre-lox技術は、個々のネフロンセグメントにおける部位特異的な遺伝子組み換えを可能にすることで、腎生理学の研究に革命をもたらした。遠位凸状尿細管（DCT）は、初期（DCT1）と後期（DCT2）の異なるセグメントから構成され、NaとKのホメオスタシスにおいて中心的な役割を果たしています。DCTを標的としたCre系はPvalb-Creのみであり、非誘導性、DCT1のみに沿った活性、神経細胞内での活性が制限されている。ここでは、DCT全体に特異的な最初のCre株の特徴を報告する。CRISPR/Cas9ターゲティングを用いて、NaClコトランスポーター（NCC）をコードするSlc12a3遺伝子のコーディング領域の下流にタモキシフェン誘導性のIRES-Cre-ERT2カセットを導入した。得られたSlc12a3-Cre-ERT2マウスをR26R-YFPレポーターマウスと交配させたところ、タモキシフェンの非存在下でNCC陽性細胞の6.3％がYFPを発現しており、最小限の漏出性が明らかになった。タモキシフェン注入後、NCC陽性細胞の91.2％でYFPの発現が観察され、NCC陽性細胞のみで発現しており、高い組換え効率とDCT特異性が明らかになった。R26R-TdTomatoマウスとの交配では、より高い漏出性（64.5％）が明らかになり、floxされた部位の感受性の差が示唆された。ウェスタンブロッティングにより、両性のSlc12a3-Cre-ERT2マウスにおけるNCCの総量または活性型リン酸化型の量は、対照と比較して差がないことが明らかになった。血漿中の[K]と[Mg]、およびチアジド感受性NaとKの排泄は、性差を比較したときに対照と比較してSlc12a3-Cre-ERT2マウスでは差がなかった。これらのデータは、遺伝子組み換えがNCC機能に明らかな影響を与えていないことを示唆している。Slc12a3-Cre-ERT2マウスは、DCT全体に沿った誘導性Cre組換え酵素活性を示す最初の系統であり、DCT機能を研究するための有用なツールとなるであろう。
Cre-lox technology has revolutionized research in renal physiology by allowing site-specific genetic recombination in individual nephron segments. The distal convoluted tubule (DCT), consisting of distinct early (DCT1) and late (DCT2) segments, plays a central role in Na and K homeostasis. The only established Cre line targeting the DCT is Pvalb-Cre, which is limited by non-inducibility, activity along DCT1 only, and activity in neurons. Here, we report the characterization of the first Cre line specific to the entire DCT. CRISPR/Cas9 targeting was used to introduce a tamoxifen-inducible IRES-Cre-ERT2 cassette downstream of the coding region of the Slc12a3 gene encoding the NaCl cotransporter (NCC). The resulting Slc12a3-Cre-ERT2 mice were crossed with R26R-YFP reporter mice which revealed minimal leakiness with 6.3% of NCC-positive cells expressing YFP in the absence of tamoxifen. After tamoxifen injection, YFP expression was observed in 91.2% of NCC-positive cells and only in NCC positive cells, revealing high recombination efficiency and DCT-specificity. Crossing to R26R-TdTomato mice revealed higher leakiness (64.5%), suggesting differential sensitivity of the floxed site. Western blotting revealed no differences in abundances of total or the active-phosphorylated form of NCC in Slc12a3-Cre-ERT2 mice of either sex compared to controls. Plasma [K] and [Mg], and thiazide-sensitive Na and K excretion did not differ in Slc12a3-Cre-ERT2 mice compared to controls when sex-matched. These data suggest genetic modification had no obvious effect on NCC function. Slc12a3-Cre-ERT2 mice are the first line generated demonstrating inducible Cre recombinase activity along the entire DCT, and will be a useful tool to study DCT function.