活性部位と二次結合部位を標的としたエコチンの好中球エラスターゼに対する阻害機構の構造的基盤

Structural basis for the inhibition mechanism of ecotin against neutrophil elastase by targeting the active site and secondary binding site.

• Chacko Jobichen
• Mahalakshmi Tirumuru Prabhakar
• Su Ning Loh
• Jayaraman Sivaraman

抄録

ヒト好中球エラスターゼ（hNE）は、細菌の感染防御に重要な役割を果たすセリンプロテアーゼである。しかし、肺がんや乳がんなどではhNEの発現上昇が報告されています。また、hNEは心肺疾患の治療薬としても注目されています。エコチン（ET）は、多くのグラム陰性菌に存在するセリンプロテアーゼ阻害剤であり、hNEを含む宿主プロテアーゼを阻害する生理的な役割を持っています。このような相互作用が知られているにもかかわらず、hNE-ET複合体の構造は報告されておらず、エコチン阻害のメカニズムは不明でした。我々は、分子置換法を用いてhNE-ET複合体の構造を解いた。その結果、ET-ET複合体の構造から、ETダイマーと独立した2つのhNEモノマーの間に、50's, 60's, 80'sループからなる6つの界面領域が存在することが明らかになり、エコチンのhNEに対する親和性が高いことを説明することができた（12pM）。特筆すべきは、一次結合部位から24Å離れた位置にhNEの二次結合部位が存在することを確認したことである。密接に関連するトリプシン-エコチン複合体と我々のhNE-ET複合体を比較すると、80年代と50年代のループのバックボーン原子の4.6Åの動きを示しており、これらのループは、プロテアーゼの範囲を阻害するための柔軟性を示唆している。詳細な構造解析を通して、我々は、阻害と同時に様々な側鎖をドッキングするためのhNEサブサイトの柔軟性を実証し、様々な阻害剤に対するhNEの広範な特異性を示しています。これらの知見は、hNEの両方の部位を標的としたキメラインヒビターの設計とhNEが媒介する病原体を制御するための治療法の開発に役立つであろう。

Human neutrophil elastase (hNE) is a serine protease that plays a major role in defending the bacterial infection. However, elevated expression of hNE is reported in lung and breast cancer, among others. Moreover, hNE is a target for the treatment of cardio pulmonary diseases. Ecotin (ET), is a serine protease inhibitor present in many gram-negative bacteria and it has a physiological role in inhibiting host proteases including hNE. Despite this known interaction, the structure of hNE-ET complex has not been reported, and the mechanism of ecotin inhibition is not available. We solved the structure of hNE-ET complex by molecular replacement method. The structure of the hNE-ET complex revealed the presence of six interface regions comprising of 50's, 60's and 80's loops, between ET dimer and two independent hNE monomers, which explains the high affinity of ecotin to hNE (12pM). Notably, we observed a secondary binding site of hNE located 24 Å away from the primary binding site. Comparison of the closely related trypsin-ecotin complex with our hNE-ET complex shows movement of the backbone atoms of the 80s and 50s loops by 4.6 Å, suggesting the flexibility of these loops to inhibit a range of proteases. Through a detailed structural analysis, we demonstrate the flexibility of the hNE subsites to dock various sidechains concomitant with inhibition, indicating the broad specificity of hNE against various inhibitors. These findings will aid in the design of chimeric inhibitors that target both sites of hNE and in the development of therapeutics to control hNE-mediated pathogenesis.