SAX-HPLCを用いた異なる植物種からの可溶性、放射性標識イノシトールポリリン酸塩の抽出と定量

Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC.

• Philipp Gaugler
• Verena Gaugler
• Marília Kamleitner
• Gabriel Schaaf

抄録

ミオイノシトールのリン酸エステルは、イノシトールリン酸塩(InsPs)とも呼ばれ、植物の生理学において重要な役割を果たす細胞調節物質の一種です。これらの分子は、負の電荷を帯びており、その存在量が少なく、加水分解活性の影響を受けやすいため、その検出と定量は困難を極めています。特に、イノシトールピロリン酸塩（PP-InsPs）とも呼ばれる「高エネルギー」ジホスホ結合を含む高度にリン酸化された形態の場合はそうです。H]-ミオ-イノシトールで標識した植物の強陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（SAX-HPLC）は、その高感度のため、現在、これらの分子を分析するために選択された方法です。H]-ミオ-イノシトールを用いて植物の苗を放射性標識することで、いくつかの非エナンチオマー異性体を含む様々なInsP種を高感度で検出し、識別することができます。ここでは、適切なSAX-HPLCシステムのセットアップ、および植物の栽培、放射性標識およびInsP抽出からSAX-HPLCの実行およびその後のデータ解析までの完全なワークフローについて説明します。ここで提示されたプロトコルは、いくつかの非エナンチオマー異性体やPP-InsP、InsP7およびInsP8を含む様々なInsP種の識別および定量を可能にし、他の植物種に容易に適応することができます。例として、シロイヌナズナとロータスの苗のSAX-HPLC分析が行われ、完全なInsPプロファイルが提示され、議論されています。ここに記載されている方法は、植物におけるInsPの生物学的役割をよりよく理解するための有望なツールを表しています。

The phosphate esters of myo-inositol, also termed inositol phosphates (InsPs), are a class of cellular regulators playing important roles in plant physiology. Due to their negative charge, low abundance and susceptibility to hydrolytic activities, the detection and quantification of these molecules is challenging. This is particularly the case for highly phosphorylated forms containing 'high-energy' diphospho bonds, also termed inositol pyrophosphates (PP-InsPs). Due to its high sensitivity, strong anion exchange high-performance liquid chromatography (SAX-HPLC) of plants labeled with [H]-myo-inositol is currently the method of choice to analyze these molecules. By using [H]-myo-inositol to radiolabel plant seedlings, various InsP species including several non-enantiomeric isomers can be detected and discriminated with high sensitivity. Here, the setup of a suitable SAX-HPLC system is described, as well as the complete workflow from plant cultivation, radiolabeling and InsP extraction to the SAX-HPLC run and subsequent data analysis. The protocol presented here allows the discrimination and quantification of various InsP species, including several non-enantiomeric isomers and of the PP-InsPs, InsP7 and InsP8, and can be easily adapted to other plant species. As examples, SAX-HPLC analyses of Arabidopsis thaliana and Lotus japonicus seedlings are performed and complete InsP profiles are presented and discussed. The method described here represents a promising tool to better understand the biological roles of InsPs in plants.