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固定化されたブタのペプシンとネペンテシン II の HDX 条件での開裂特異性の比較解析
Comparative analysis of cleavage specificities of immobilized porcine pepsin and Nepenthesin II under HDX conditions.
PMID: 32658454 DOI: 10.1021/acs.analchem.9b05694.
抄録
水素/重水素交換 (HDX) と質量分析法 (HDX-MS) は、タンパク質の構造変化やタンパク質-リガンド相互作用を調べるための感度の高い堅牢な方法です。HDX-MSは、酸性条件下での標的タンパク質のタンパク質分解分解に成功し、タンパク質構造への交換挙動の摂動を局在化することに依存しています。小さなペプチドや重複する断片を生成し、タンパク質配列の十分なカバレッジを提供するプロテアーゼの能力は、関心のある領域をローカライズするために不可欠です。酸性プロテアーゼであるペプシンはHDX-MS研究のための酵素として選択されてきたが、最近、ネペンテス属の肉食性ピッチャー植物由来のアスパラギン酸プロテアーゼが低pH条件下で活性を示し、ペプシン消化物では「禁止」されている塩基性残基で切断することが示された。本報告では、これらの酵素の一つであるNepenthesin II (NepII)のHDX-MSワークフローにおける有用性について述べる。プロテアーゼ切断特異性を調べるために、固定化したブタのペプシンまたはNepIIで消化した11種類のタンパク質（6,391アミノ酸残基）のデータをHDX-MSと互換性のある条件下で系統的かつ統計的に解析した。ペプシンの開裂は、P1位置のアミノ酸残基に最も影響を受けた。Phe、LeuおよびMetは、それぞれ40％以上の開裂確率で好ましい残基である。His、Lys、Arg、またはPro残基はP1位置で発見された場合、開裂を禁止している。対照的に、NepIIはすべての塩基性残基に対して有利な開裂を提供し、HDX-MS研究における空間分解能を向上させる可能性のある短縮ペプチドを生成する。
Hydrogen/Deuterium Exchange (HDX) coupled with Mass Spectrometry (HDX-MS) is a sensitive and robust method to probe protein conformational changes and protein-ligand interactions. HDX-MS relies on successful proteolytic digestion of target proteins under acidic conditions to localize perturbations in exchange behavior to protein structure. The ability of the protease to produce small peptides and overlapping fragments and provide sufficient coverage of the protein sequence is essential for localizing regions of interest. While the acid protease pepsin has been the enzyme of choice for HDX-MS studies, recently, it was shown that aspartic proteases from carnivorous pitcher plants of the genus Nepenthes are active under low pH conditions and cleave at basic residues that are 'forbidden' in peptic digests. In this report, we describe the utility of one of these enzymes, Nepenthesin II (NepII), in an HDX-MS workflow. Systematic and statistical analysis of data from 11 proteins (6,391 amino acid residues) digested with immobilized porcine pepsin or NepII under conditions compatible with HDX-MS was performed to examine protease cleavage specificities. The cleavage of pepsin was most influenced by the amino acid residue at position P1. Phe, Leu and Met are favored residues each with a cleavage probability greater than 40%. His, Lys, Arg, or Pro residues prohibit cleavage when found at the P1 position. In contrast, NepII offers advantageous cleavage to all basic residues and produce shortened peptides that could improve the spatial resolution in HDX-MS studies.