CRISPR-dCas9を用いたクリッカブルクロマチンへの末端ウリジリルトランスフェラーゼによる部位特異的アクセス

Terminal Uridylyl Transferase Mediated Site-Directed Access to Clickable Chromatin Employing CRISPR-dCas9.

• Jerrin Thomas George
• Mohd Azhar
• Meghali Aich
• Dipanjali Sinha
• Uddhav B Ambi
• Souvik Maiti
• Debojyoti Chakraborty
• Seergazhi G Srivatsan

抄録

タンパク質や低分子などの機能性プローブを用いた標的遺伝子の部位特異的な探索は、遺伝子機能の分子基盤を解明し、その下流への影響を調節するためのツールを設計する上で最も重要である。このような背景から、CRISPRを用いた遺伝子編集・標的化技術は、シングルガイドRNA（sgRNA）の配列を変更するだけで、目的の遺伝子を標的とするようにプログラムすることができるため、非常に有用であることが証明されている。これらの技術は、機能性タンパク質のリクルートに広く利用されていますが、CRISPRシステムを用いた低分子の表示技術は、十分な技術がないために十分に開発されていません。本研究では、ガイドRNAをリモデリングするための生物学的クリック化学の力を利用して、標的遺伝子上に合成分子を表示する技術を開発しました。低侵襲なアジドハンドルの存在は、sgRNAが実際に機能的であることを保証した。特に、テロメリックリピートを標的としたアジドテールのsgRNAは、CRISPR-dCas9システムのトロイの木馬として機能し、銅触媒または株を用いたクリック反応を用いて、クロマチン上の合成タグ（ビオチン）を特定の部位に誘導しました。これらの結果から、sgR-CLKは、生物学的化学、TUTase、CRISPRツールボックスの有用性を飛躍的に向上させ、標的遺伝子上での低分子プローブや診断ツールの部位特異的表示のためのシンプルなソリューションを提供することができた。

Locus-specific interrogation of target genes employing functional probes such as proteins and small molecules is paramount in decoding the molecular basis of gene function and designing tools to modulate its downstream effects. In this context, CRISPR-based gene editing and targeting technologies have proved tremendously useful as they can be programmed to target any gene of interest by simply changing the sequence of the single guide RNA (sgRNA). Although these technologies are widely utilized in recruiting genetically encoded functional proteins, display of small molecules using CRISPR system is not well developed due to the lack of adequate techniques. Here, we have devised an innovative technology called sgRNA-Click (sgR-CLK) that harnesses the power of bioorthogonal click chemistry for remodeling guide RNA to display synthetic molecules on target genes. sgR-CLK employs a novel posttranscriptional chemo-enzymatic labeling platform wherein a terminal uridylyl transferase (TUTase) was repurposed to generate clickable sgRNA of choice by site-specific tailoring of multiple azide-modified nucleotide analogs at the 3' end. The presence of a minimally invasive azide handle assured that the sgRNAs are indeed functional. Notably, an azide-tailed sgRNA targeting the telomeric repeat served as a Trojan horse on CRISPR-dCas9 system to guide synthetic tags (biotin) site-specifically on chromatin employing copper-catalyzed or strain-promoted click reactions. Taken together, sgR-CLK presents a significant advancement on the utility of bioorthogonal chemistry, TUTase and CRISPR toolbox, which could offer a simplified solution for site-directed display of small molecule probes and diagnostic tools on target genes.