小児の唾液、歯肉クレヴィクル液、部位特異的バイオフィルムサンプルから抽出されたDNAの比較

Comparison of DNA Extracted from Pediatric Saliva, Gingival Crevicular Fluid and Site-Specific Biofilm Samples.

• Jason Emett
• Roxanne David
• Jaydene McDaniel
• Steven McDaniel
• Karl Kingsley

抄録

(1) はじめに。唾液の非侵襲性のため、微生物スクリーニングのために唾液サンプルからDNAを分離して収集するために多くの方法が使用されてきました。また、多くの口腔内微生物が口腔内バイオフィルムに生息しており、齲蝕や歯周病などの口腔内の健康や疾患に寄与する可能性のある有意に異なる微生物の構成要素を表している可能性がある。さらに、バイオフィルムは、同じ患者内でも部位によって異なる場合がある。唾液から分離された DNA と部位特異的バイオフィルムからの DNA の比較を評価した研究はほとんどなく、小児患者の間でこの分析に取り組んでいる研究は事実上ない。(2) 方法。小児患者（= 47）から以前に収集されたペーパーポイント由来のバイオフィルム、歯肉粘膜液（GCF）、および刺激を受けていない唾液サンプルの既存のリポジトリが同定された。バイオフィルム部位（舌、上頬骨臼歯、下顎舌側切歯）から DNA を単離し、GCF と唾液をフェノール：クロロホルム抽出を用いた定量的 DNA 比較に使用した。ナノドロップ2000分光光度計を用いて、A230 nm、A260 nm、A280 nm の吸光度測定値を用いて定性・定量分析を行った。(3) 結果。これらのデータは、すべての患者サンプルからDNAの分離に成功したことを示しており、最も高い濃度が非刺激性唾液（4264.1 ng/μL）、最も低い濃度がGCFに由来する（1771.5 ng/μL）で観察された。男性と女性、またはマイノリティと非マイノリティの間で差は観察されなかった。また、成人サンプルから得られた全体のDNA濃度を比較すると、小児サンプルから得られた濃度よりもわずかに高かったが、有意差は認められなかった（＝0.2827）。リアルタイム定量的qPCRによるスクリーニングの結果，評価したすべての検体に，検出限界を超える分子スクリーニングに十分な量と質の細菌およびヒトのDNAが含まれていた（ΔRn = 0.01）．(4) 結論。唾液および口腔内の特定部位のサンプリングおよびスクリーニングを提供するために、多くの方法が現在利用可能であるが、ペーパーポイントサンプリングおよび非刺激性唾液採取を含む単純かつ低コストの方法の検証および比較は、これらの方法およびプロトコルが分子スクリーニングおよび他の比較アプリケーションのための十分なDNA品質および量を提供することを示唆している可能性がある。さらに、不均一性は患者サンプル間で一定かつ一貫した特徴となるが、様々な口腔部位からの類似かつ一貫したＤＮＡを提供する標準化された方法は、スクリーニングおよび分子分析のために必要とされる一貫性を提供するかもしれない。

(1) Introduction: Due to the non-invasive nature of saliva, many methods have been used to isolate and collect DNA from saliva samples for microbial screening. Many oral microbes also inhabit the oral biofilm, which may represent significantly different microbial constituents that may contribute to oral health and disease, including caries and periodontal disorders. Moreover, the biofilm may vary within the same patient at different sites. Few studies have evaluated the comparison between DNA isolated from saliva and DNA from site-specific biofilm, with virtually no studies addressing this analysis among pediatric patients. (2) Methods: An existing repository of paper point derived biofilm, gingival crevicular fluid (GCF), and unstimulated saliva samples previously collected from pediatric patients ( = 47) was identified. DNA was isolated from biofilm sites (tongue, upper buccal molar, mandibular lingual incisor), and GCF and saliva were used for quantitative DNA comparison using a phenol:chloroform extraction. A quantitative and qualitative analysis was performed using the NanoDrop 2000 spectrophotometer using absorbance readings at A230 nm, A260 nm and A280 nm. (3) Results: These data demonstrated the successful isolation of DNA from all of the patient samples, with the highest concentrations observed among unstimulated saliva (4264.1 ng/μL) and the lowest derived from GCF (1771.5 ng/μL). No differences were observed between males and females or minorities and non-minority patients. In addition, comparison of the overall concentrations of DNA obtained from adult samples was slightly higher than, but not significantly different from, the concentrations obtained from pediatric samples ( = 0.2827). A real-time quantitative qPCR screening revealed that all of the samples evaluated harbored bacterial and human DNA of sufficient quantity and quality for a molecular screening greater than the limit of detection (ΔRn = 0.01). (4) Conclusions: Many methods are currently available to provide the sampling and screening of saliva and specific sites within the oral cavity, but the validation and comparison of simple and low-cost methods, that include paper point sampling and unstimulated saliva collection, may suggest these methods and protocols provide sufficient DNA quality and quantity for molecular screening and other comparison applications. In addition, although heterogeneity will be a constant and consistent feature between patient samples, standardized methods that provide similar and consistent DNA from various oral sites may provide needed consistency for screening and molecular analysis.