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インテグリンはフィブロネクチン機能化カンプトテシン負荷DNA-ナノファイバーの内部化を促進し、高効率の抗癌効果をもたらした
The integrin facilitated internalization of fibronectin-functionalized camptothecin-loaded DNA-nanofibers for high-efficiency anticancer effects.
PMID: 32661832 DOI: 10.1007/s13346-020-00820-6.
抄録
遊離型のカンプトテシン(CMPT)は、疎水性薬物と同様に極めて細胞毒性が強く、全身投与では伝染性が高いと考えられている。フィブロネクチン（FN）を機能化したDNAベースのナノキャリアは、CMPTとA549癌細胞に高発現しているインテグリン（αvβ3）受容体を標的とし、これを担持するように設計されています。ここでは、DNA二重鎖のGC(塩基対)リッチ領域に鎖をインターカレーションすることで、CMPTを担持することが可能なDNAナノファイバー(DNA-NF)の形をしたDNAナノキャリアを報告している。そこで私たちは、DNA-NFがCMPTを負荷する可能性を探り、インテグリンが豊富なA549癌細胞に対する治療効果を高め、インテグリンを欠失したHEK293細胞に対する細胞毒性を低減させるという観点から、その成果を評価することを切実な目的としています。DNA-NFは、DNA三角形のポリマーとして製剤化されている。DNA三角形は、頂点に存在する相補的なオーバーハングを介してプログラムされた方法で配列されている。ＤＮＡ三角形は、主に、特定の配列の３つの異なるステープルストランドを有する新鮮な円形化された足場ストランドのアニーリングによって得られた。重合した三角形のタイルは、二次元ナノシートを形成する代わりに、セルフコイリングを経てDNA-NF型構造を形成した。フローサイトメトリーおよびMTTアッセイを行い、インテグリンが豊富なA549癌細胞の細胞毒性およびアポトーシス効果をインテグリン欠損HEK293細胞と比較して観察した。AFM、ネイティブページ、および共焦点実験により、DNAの三角形の重合と、得られるナノ構造の形態を確認した。AFMおよび共焦点画像から、DNA-NFの長さは3〜6μm、幅は70〜110nmであることが明らかになった。また、DNA-NFのアミノ修飾鎖を用いたアミド化学によるFNの機能化(TAMRAタグ付き;赤色蛍光)と、DNA-NFのGCリッチ領域へのCMPT負荷(鎖のインターカレーションを介した)をUVシフト分析(>10nmシフト)と共焦点イメージングにより確認した。ブランクDNA-NFは、2-640μMの濃度で生体適合性が高いことが確認された。CMPTを添加したDNA-NFは、インテグリンが豊富なA549癌細胞に対して、インテグリン欠損HEK293細胞と比較して、細胞生存率が用量依存的に低下することが明らかになった。結論として，FN 機能化 CMPT 負荷 DNA-NF は，インテグリン欠損 HEK293 細胞と比較して，インテグリンが豊富な A549 癌細胞を標的的に効果的に破壊した．図式的要約。
Camptothecin (CMPT) in a free form is extremely cytotoxic as well as hydrophobic drug, and is considered to be highly contagious for systemic administration. The fibronectin (FN)-functionalized DNA-based nanocarrier has been designed to load CMPT and target integrin (αvβ3) receptors which are highly expressed on the A549 cancer cells. Here, we report DNA nanocarrier in the form of DNA-nanofibers (DNA-NFs) capable of loading CMPT via strand intercalation in the GC (base pairs)-rich regions of the DNA duplex. Hence, our keen purpose was to explore the potential of DNA-NFs to load CMPT and assess the improvements of the outcomes in terms of enhanced therapeutic effects to integrin-rich A549 cancer cells with reduced cytotoxic effects to integrin-lacking HEK293 cells. DNA-NFs were formulated as a polymer of DNA triangles. DNA triangles arranged in a programmed way through the complementary overhangs present at the vertices. DNA triangles were primarily obtained through the annealing of the freshly circularized scaffold strands with the three distinct staple strands of specific sequences. The polymerized triangular tiles instead of forming two-dimensional nanosheets underwent self-coiling to give rise to DNA-NF-shaped structures. Flow cytometry and MTT assays were performed to observe cytotoxic and apoptotic effects on integrin-rich A549 cancer cells compared with the integrin-deficient HEK293 cells. AFM, native-page, and confocal experiments confirmed the polymerization of DNA triangles and the morphology of the resulting nanostructures. AFM and confocal images revealed the length of DNA-NFs to be 3-6 μm and the width from 70 to 110 nm. CMPT loading (via strands intercalation) in GC-rich regions of DNA-NFs and the FN functionalization (TAMRA tagged; red fluorescence) via amide chemistry using amino-modified strands of DNA-NFs were confirmed through the UV-shift analysis (> 10 nm shift) and confocal imaging. Blank DNA-NFs were found to be highly biocompatible in 2-640 μM concentrations. MTT assay and flow cytometry experiments revealed that CMPT-loaded DNA-NFs showed a dose-dependent decrease in the cell viability to integrin-rich A549 cancer cells compared with the integrin-deficient HEK293 cells. Conclusively, FN-functionalized, CMPT-loaded DNA-NFs effectively destroyed integrin-rich A549 cancer cells in a targeted manner compared with integrin-deficient HEK293 cells. Grapical abstract.