日本語AIでPubMedを検索
ゼブラフィッシュ精子細胞における先端型エレクトロポレーションを用いた効率性と細胞生存性の意味合い
Efficiency and cell viability implications using tip type electroporation in zebrafish sperm cells.
PMID: 32661869 PMCID: PMC7356131. DOI: 10.1007/s11033-020-05658-2.
抄録
精子媒介遺伝子導入（SMGT）は、ゼブラフィッシュの遺伝子導入に利用できる可能性がある。しかし、魚の精子細胞へのトランスフェクションはまだ改良が必要である。本研究の目的は、ゼブラフィッシュ精子へのチップ型エレクトロポレーションの実現可能性を実証することであり、副作用を最小限に抑えながら高いトランスフェクション効率を提供するプロトコールを示すことであった。精子は、500から1500Vまでの電圧でチップ型エレクトロポレーションを使用してCy3標識DNAでトランスフェクションされました。精子の動態パラメータはコンピュータ支援精液分析（CASA）を用いて評価し、細胞の完全性、活性酸素種（ROS）、ミトコンドリアの機能性、およびトランスフェクション率をフローサイトメトリーで評価した。転移率はチップ型エレクトロポレーションの影響を受け、最も低い電圧（500V）では64.9％±3.6％、最も高い電圧（1500V）では86.6％±1.9％となった。また、電気導入したサンプルの全体的な運動性のある精子の割合は、電界強度の増加とともに減少することがわかった(P<0.05)。精子の損傷した漿膜の増加は、電界強度の増加に伴って観察された(P<0.05)。活性酸素と精子のミトコンドリア機能はエレクトロポレーション後に負の反応を示さなかった(P>0.05)。全体的な結果は、チップ型エレクトロポレーションがゼブラフィッシュ精子細胞への外因性DNAの内部化を、精子細胞への有害な影響を最小限に抑えて促進することを示している。
Sperm-mediated gene transfer (SMGT) has a potential use for zebrafish transgenesis. However, transfection into fish sperm cells still needs to be improved. The objective was to demonstrate the feasibility of tip type electroporation in zebrafish sperm, showing a protocol that provide high transfection efficiency, with minimal side-effects. Sperm was transfected with a Cy3-labelled DNA using tip type electroporation with voltages ranging from 500 to 1500 V. Sperm kinetics parameters were assessed using Computer Assisted Semen Analysis (CASA) and cell integrity, reactive oxygen species (ROS), mitochondrial functionality and transfection rate were evaluated by flow cytometry. The transfection rates were positively affected by tip type electroporation, reaching 64.9% ± 3.6 in the lowest voltage used (500 V) and 86.6% ± 1.9 in the highest (1500 V). The percentage of overall motile sperm in the electrotransfected samples was found to decrease with increasing field strength (P < 0.05). Increase in the sperm damaged plasma membrane was observed with increasing field strength (P < 0.05). ROS and sperm mitochondrial functionality did not present a negative response after the electroporation (P > 0.05). Overall results indicate that tip type electroporation enhances the internalization of exogenous DNA into zebrafish sperm cells with minimal harmful effects to sperm cells.