シロイヌナズナ葉緑体グルタミルペプチダーゼの自動触媒処理と基質特異性

Auto-catalytic processing and substrate specificity of Arabidopsis chloroplast glutamyl peptidase.

• Nazmul H Bhuiyan
• Elden Rowland
• Giulia Friso
• Lalit Ponnala
• Elena Js Michel
• Klaas Jan van Wijk

抄録

葉緑体のプロテオスタシスは、ペプチダーゼのネットワークによって支配されている。このネットワークの一部として、シロイヌナズナ（シロイヌナズナ）葉緑体グルタミルペプチダーゼ（CGEP）が、エキソペプチダーゼとエンドペプチダーゼの両方の活性を持つホモオリゴマー性ストロマールセリン型（S9D）ペプチダーゼであることを明らかにした。シロイヌナズナCPEGヌル変異体（CGEP）は、目に見える表現型を示さなかったが、ストロマールCLPプロテアーゼシステム変異体との強い遺伝的相互作用を示し、生育の低下をもたらした。CGEPの欠損は葉緑体タンパク質のシャペロン機構と70Sリボソームタンパク質を増加させたが、プロテオスタシスネットワークの他の部分には影響を与えなかった。比較プロテオミクスとmRNAを用いた共発現解析の結果、CGEPの機能がデンプン代謝の制御に少なくとも部分的に関与していることが示唆された。CGEPは25 kDa以下のペプチドやタンパク質を分解した。CGEPはGluのC末端側の基質を特異的に切断することがわかった。CGEPはE946で自己触媒的にC末端側の基質を切断し、15残基を除去することが示された。E946のすぐ上流に保存されているモチーフ（A[S/T]GGG[N/G]PE946）が双子葉で確認されたが、単子葉では確認されなかった。構造モデル化により、C末端処理は触媒キャビティへのアクセスを改善することで、基質サイズの上限を増加させることが示唆された。触媒的に不活性なCGEP-S781RまたはCGEP clpr2-1バックグラウンドでC末端処理されていないCGEPバリアントとのin vivoでの相補化は、CGEPペプチダーゼ活性とその自己触媒処理の両方の生理学的重要性を実証するために使用された。光合成細菌および非光合成細菌のCGEPホモログは、C末端プロシークエンスを欠いており、植物における最近の機能的適応であることを示唆している。

Chloroplast proteostasis is governed by a network of peptidases. As a part of this network, we show that Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) chloroplast glutamyl peptidase (CGEP) is a homo-oligomeric stromal serine-type (S9D) peptidase with both exo- and endo-peptidase activity. Arabidopsis CPEG null mutant alleles (cgep) had no visible phenotype but showed strong genetic interactions with stromal CLP protease system mutants, resulting in reduced growth. Loss of CGEP upregulated the chloroplast protein chaperone machinery and 70S ribosomal proteins, but other parts of the proteostasis network were unaffected. Both comparative proteomics and mRNA-based co-expression analyses strongly suggested that the function of CGEP is at least partly involved in starch metabolism regulation. Recombinant CGEP degraded peptides and proteins smaller than ~25 kDa. CGEP specifically cleaved substrates on the C-terminal side of Glu irrespective of neighboring residues, as shown using peptide libraries incubated with recombinant CGEP and mass spectrometry. CGEP was shown to undergo auto-catalytic C-terminal cleavage at E946, removing 15 residues, both in vitro and in vivo. A conserved motif (A[S/T]GGG[N/G]PE946) immediately upstream of E946 was identified in dicotyledons, but not monocotyledons. Structural modeling suggested that C-terminal processing increases the upper substrate size limit by improving catalytic cavity access. In vivo complementation with catalytically inactive CGEP-S781R or a CGEP variant with an unprocessed C-terminus in a cgep clpr2-1 background was used to demonstrate the physiological importance of both CGEP peptidase activity and its autocatalytic processing. CGEP homologs of photosynthetic and non-photosynthetic bacteria lack the C-terminal prosequence, suggesting it is a recent functional adaptation in plants.

{copyright, serif} 2020 American Society of Plant Biologists. All rights reserved.