欠損したウラシル塩基の切除修復は、単球およびマクロファージの感染中にHIVプロウイルスの持続的なdUMPを導く

Deficient uracil base excision repair leads to persistent dUMP in HIV proviruses during infection of monocytes and macrophages.

• Mesfin Meshesha
• Alexandre Esadze
• Junru Cui
• Natela Churgulia
• Sushil Kumar Sahu
• James T Stivers

抄録

単球やマクロファージなどの骨髄系の非分裂細胞は、低いdNTPプール濃度と高いdUTPレベルを持つHIVの標的細胞であり、これは逆転写（「ウラシル化」）の間にAと反対側のdUMPの頻繁な取り込みにつながる。プロウイルスDNA中のdUMPの運命を決定する要因の一つは、宿主細胞のウラシル塩基切除修復（UBER）システムである。ここでは、ウイルスのdUMPがHIVの多様化と感染性に与える影響を理解するために、単球（MC）と単球由来マクロファージ（MDM）の相対的なUBER能力と、両細胞型における統合型ウラシル化ウイルスの運命を調査した。我々は、MC感染のためのカイネティクスは、in vivoでのそれらの寿命と互換性があり、それらのhUNG2活性のほぼ不在は、少なくともUBERが可能になるマクロファージに分化するまで、高レベルでのウイルスdUMPの保持と一致していることを発見した。感染前のMDMにおけるヒトウラシルDNAグリコシラーゼの過剰発現は、HIV cDNAからのdUMPの急速な除去と、dUMPを含むウイルスコピーのほぼ完全な枯渇をもたらした。この知見は、これらの細胞における低いhUNG2発現レベルがUBERを制限するが、hUNG2がウラシル化ウイルスに対して制限的であることを立証する。対照的に、ウイルス統合後のhUNG2の過剰発現は、ウラシルの切除を促進しなかったが、これは、ウラシルがクロマチンの文脈ではアクセスしにくい可能性があることを示唆している。我々は、dUMPが組み込まれたウイルスDNA分子が、dUMPが存在しないときには観察されなかったユニークな（＋）鎖変換変異を含むことを発見した（G→T、T→A、T→G、A→C）。これらの観察および他の考慮事項は、テンプレートがRNAである場合、dUMPは主に(-)鎖合成の間にエラーを導入することを示唆している。全体的に、MCのin vitro感染から機能的なウイルスを産生する可能性は、MDMおよび活性化T細胞と比較して約50倍および300倍減少しています。以上の結果から、MCおよびMDMにおけるウイルスdUMPの組み込みは、ヒトHIV感染時のウイルス多様化および制限経路としての可能性を示唆している。

Non-dividing cells of the myeloid lineage such as monocytes and macrophages are target cells of HIV that have low dNTP pool concentrations and elevated levels of dUTP, which leads to frequent incorporation of dUMP opposite to A during reverse transcription ("uracilation"). One factor determining the fate of dUMP in proviral DNA is the host cell uracil base excision repair (UBER) system. Here we explore the relative UBER capacity of monocytes (MC) and monocyte-derived macrophages (MDM) and the fate of integrated uracilated viruses in both cell types to understand the implications of viral dUMP on HIV diversification and infectivity. We find that the kinetics for MC infection is compatible with their lifetime in vivo and their near absence of hUNG2 activity is consistent with the retention of viral dUMP at high levels at least until differentiation into macrophages, where UBER becomes possible. Overexpression of human uracil DNA glycosylase in MDM prior to infection resulted in rapid removal of dUMP from HIV cDNA and near complete depletion of dUMP-containing viral copies. This finding establishes that the low hUNG2 expression level in these cells limits UBER but that hUNG2 is restrictive against uracilated viruses. In contrast, overexpression of hUNG2 after viral integration did not accelerate the excision of uracils, suggesting that they may poorly accessible in the context of chromatin. We found that viral DNA molecules with incorporated dUMP contained unique (+) strand transversion mutations that were not observed when dUMP was absent (G→T, T→A, T→G, A→C). These observations and other considerations suggest that dUMP introduces errors predominantly during (-) strand synthesis when the template is RNA. Overall, the likelihood of producing a functional virus from in vitro infection of MC is about 50-fold and 300-fold reduced as compared to MDM and activated T cells. The results implicate viral dUMP incorporation in MC and MDM as a potential viral diversification and restriction pathway during human HIV infection.