DNA検出と等温指数シグナル増幅のための制限エンドヌクレアーゼベースのアッセイ

Restriction Endonuclease-Based Assays for DNA Detection and Isothermal Exponential Signal Amplification.

• Maria Smith
• Kenneth Smith
• Alan Olstein
• Andrew Oleinikov
• Andrey Ghindilis

抄録

核酸を特異的に検出するために制限酵素（REase）を使用することで、高いアッセイ特異性、利便性、低コストを実現しています。直接制限アッセイは、ターゲットプローブハイブリッドを酵素で特異的に切断し、それに伴い分子マーカーを溶液中に放出することで、ターゲットの定量化を可能にします。この測定法では、検出限界がナノモルの範囲にあります。自己永続的な制限エンドヌクレアーゼ反応のカスケードに基づく指数関数的なシグナル増幅を実装することで、アッセイ感度をアトモルレベルまで飛躍的に向上させています。このカスケードは増幅の「トリガー」の作用によって開始されます。トリガーは、標的特異的プローブを介して固定化されます。ターゲットプローブのハイブリダイゼーションに続いて特異的な切断が行われると、トリガーは反応溶液中に放出されます。反応液はその後、アッセイ増幅ステージに添加され、遊離したトリガーは増幅プローブの開裂を誘導し、このようにしてREアーゼ触媒イベントの自己永続的なカスケードを開始します。新しい増幅プローブの連続的な開裂は、新しいトリガーの指数関数的な放出および急速な指数関数的なシグナル増幅を導く。提案されたフォーマットは、関連するコスト、時間、労力の何分の一かで同様の感度を達成するqPCRに代わる有効な等温法を例示するものである。このアプローチの利点と課題が議論されています。

Application of restriction endonuclease (REase) enzymes for specific detection of nucleic acids provides for high assay specificity, convenience and low cost. A direct restriction assay format is based on the specific enzymatic cleavage of a target-probe hybrid that is accompanied with the release of a molecular marker into the solution, enabling target quantification. This format has the detection limit in nanomolar range. The assay sensitivity is improved drastically to the attomolar level by implementation of exponential signal amplification that is based on a cascade of self-perpetuating restriction endonuclease reactions. The cascade is started by action of an amplification "trigger". The trigger is immobilized through a target-specific probe. Upon the target probe hybridization followed with specific cleavage, the trigger is released into the reaction solution. The solution is then added to the assay amplification stage, and the free trigger induces cleavage of amplification probes, thus starting the self-perpetuating cascade of REase-catalyzed events. Continuous cleavage of new amplification probes leads to the exponential release of new triggers and rapid exponential signal amplification. The proposed formats exemplify a valid isothermal alternative to qPCR with similar sensitivity achieved at a fraction of the associated costs, time and labor. Advantages and challenges of the approach are discussed.