PUF60およびU2AF65のRNA認識モチーフにおけるがん関連の置換により、正しいフォールディングと3'スプライスサイト選択に必要な残基が明らかになった

Cancer-Associated Substitutions in RNA Recognition Motifs of PUF60 and U2AF65 Reveal Residues Required for Correct Folding and 3' Splice-Site Selection.

• Jana Kralovicova
• Ivana Borovska
• Monika Kubickova
• Peter J Lukavsky
• Igor Vorechovsky

抄録

U2AF65 ()とPUF60 ()は、U2小核リボヌクレオタンパク質のラリアット分岐点へのリクルートと3'スプライスサイト(3's)の選択に重要なスプライシング因子である。両タンパク質は、RNA認識モチーフ（RRM）を介して3'sの上流にあるウリジンに富んだ配列に優先的に結合する。ここでは、がん患者で報告されている36のRRM置換を調べ、3'ssの選択、RNA結合、タンパク質の特性を変化させる変異体を同定した。枯渇細胞のRNA-seqによって以前に同定されたPUF60およびU2AF65依存性の3'sを用いて、U2AF65およびPUF60における独立したRRM変異の43％（10/23）および15％（2/13）が、それぞれスプライシングの欠損をもたらすことを見いだした。少なくとも3つのRRM変異は、内部エクソンのスキップを増加させた（〜9％、2/23）または（〜8％、1/13）ことから、癌に関連したRRM変異はスプライシングに-と-の両方の効果を持ちうることが示された。また、各タンパク質の正しいフォールディング/安定性に必要な残基を報告し、U2AF65とPUF60の既存の高分解能構造に機能的なRRM置換をマップした。これらの結果は、3'ss選択に重要な新しいRRM残基を同定し、mRNAアイソフォームの多様性を高めるクローナルなRRM変異を検出するための比較的簡単なツールを提供するものである。

U2AF65 () and PUF60 () are splicing factors important for recruitment of the U2 small nuclear ribonucleoprotein to lariat branch points and selection of 3' splice sites (3'ss). Both proteins preferentially bind uridine-rich sequences upstream of 3'ss via their RNA recognition motifs (RRMs). Here, we examined 36 RRM substitutions reported in cancer patients to identify variants that alter 3'ss selection, RNA binding and protein properties. Employing PUF60- and U2AF65-dependent 3'ss previously identified by RNA-seq of depleted cells, we found that 43% (10/23) and 15% (2/13) of independent RRM mutations in U2AF65 and PUF60, respectively, conferred splicing defects. At least three RRM mutations increased skipping of internal (~9%, 2/23) or (~8%, 1/13) exons, indicating that cancer-associated RRM mutations can have both - and -acting effects on splicing. We also report residues required for correct folding/stability of each protein and map functional RRM substitutions on to existing high-resolution structures of U2AF65 and PUF60. These results identify new RRM residues critical for 3'ss selection and provide relatively simple tools to detect clonal RRM mutations that enhance the mRNA isoform diversity.