大腸菌-サッカロミセス・セレビシエ共培養のモジュール工学による新規レスベラトロール生産

De novo resveratrol production through modular engineering of an Escherichia coli-Saccharomyces cerevisiae co-culture.

• Shuo-Fu Yuan
• Xiunan Yi
• Trevor G Johnston
• Hal S Alper

抄録

背景:

レスベラトロールは植物の二次代謝物であり、多様で潜在的な健康増進効果を持っています。栄養補助食品としてのメリットから、微生物工学によるレスベラトロールの生物生産が注目を集めており、持続不可能な化学合成や植物からの直接抽出に代わる方法を提供しています。しかし、微生物によるレスベラトロールの生産に関する多くの研究は、水に不溶性のフェニルアラニンまたはチロシンベースの前駆体を培地に添加して実施されており、生物生産の持続可能な発展には限界がある。

BACKGROUND: Resveratrol is a plant secondary metabolite with diverse, potential health-promoting benefits. Due to its nutraceutical merit, bioproduction of resveratrol via microbial engineering has gained increasing attention and provides an alternative to unsustainable chemical synthesis and straight extraction from plants. However, many studies on microbial resveratrol production were implemented with the addition of water-insoluble phenylalanine or tyrosine-based precursors to the medium, limiting in the sustainable development of bioproduction.

結果:

ここでは、2つの異なる代謝背景種がレスベラトロールの複合総合成とデノボ生合成のためにモジュール化された新しい培養プラットフォームを提示します。このシナリオでは、上流のEscherichia coliモジュールは、Trichosporon cutaneum（TAL）からのコドン最適化されたチロシンアンモニアリアーゼの構成的な過剰発現を介して周囲の培地にp-クマリン酸を排泄することが可能である、フィードバック阻害耐性3-デオキシ-d-アラビノヘプトゥロソネート-7-リン酸合成酵素（AROG）と転写調節因子tyrRノックアウト株におけるコリスメート変異体/プレフェネートデヒドロゲナーゼ（tyrA）を介して。次に、前駆体マロニル-CoA供給を増強するために、シロイヌナズナ由来の4-クマレート-CoAリガーゼ(4CL)とVitis vinifera由来のレスベラトロール合成酵素(STS)を構成的に発現する下流のSaccharomyces cerevisiaeモジュールにアセチル-CoAカルボキシラーゼ(ACC1)の不活性化耐性バージョンを導入し、p-クマレート酸からレスベラトロールへの変換をさらに向上させた。2つの集団の初期接種率、発酵温度、培養時間を最適化した結果、フラスコ中のグルコースから28.5mg/Lのレスベラトロールが得られた。試験管スケールで初期の純細胞密度を増加させることによってさらに最適化すると、36mg/Lの最終的なレスベラトロール力価が達成されました。

RESULTS: Here we present a novel coculture platform where two distinct metabolic background species were modularly engineered for the combined total and de novo biosynthesis of resveratrol. In this scenario, the upstream Escherichia coli module is capable of excreting p-coumaric acid into the surrounding culture media through constitutive overexpression of codon-optimized tyrosine ammonia lyase from Trichosporon cutaneum (TAL), feedback-inhibition-resistant 3-deoxy-d-arabinoheptulosonate-7-phosphate synthase (aroG) and chorismate mutase/prephenate dehydrogenase (tyrA) in a transcriptional regulator tyrR knockout strain. Next, to enhance the precursor malonyl-CoA supply, an inactivation-resistant version of acetyl-CoA carboxylase (ACC1) was introduced into the downstream Saccharomyces cerevisiae module constitutively expressing codon-optimized 4-coumarate-CoA ligase from Arabidopsis thaliana (4CL) and resveratrol synthase from Vitis vinifera (STS), and thus further improve the conversion of p-coumaric acid-to-resveratrol. Upon optimization of the initial inoculation ratio of two populations, fermentation temperature, and culture time, this co-culture system yielded 28.5 mg/L resveratrol from glucose in flasks. In further optimization by increasing initial net cells density at a test tube scale, a final resveratrol titer of 36 mg/L was achieved.

結論:

本研究は、大腸菌とセレビシエの合成コンソーシアムを用いた新規レスベラトロール生合成を実証した最初の研究であり、他のp-クマリン酸やレスベラトロール由来の生化学物質の生産の可能性を強調しています。

CONCLUSIONS: This is first study that demonstrates the use of a synthetic E. coli-S. cerevisiae consortium for de novo resveratrol biosynthesis, which highlights its potential for production of other p-coumaric-acid or resveratrol derived biochemicals.