Enterobacter aerogenes B19由来グリコシドヒドロラーゼファミリー1に属する新規β-マンナナーゼの発現、ホモロジーモデル化および酵素学的特性評価

Expression, homology modeling and enzymatic characterization of a new β-mannanase belonging to glycoside hydrolase family 1 from Enterobacter aerogenes B19.

• Siyu Liu
• Tangbing Cui
• Yan Song

抄録

背景:

β-マンナナーゼは、エンドグリコシダーゼと同様にマンナンのβ-1,4グリコシド結合を加水分解してマンナンオリゴ糖を生成することができる。現在、β-マンナナーゼは食品、医薬品、繊維、製紙、石油開発などの分野に広く応用されており、様々な生物に広く存在しているが、その主な供給源は微生物である。微生物のβ-マンナンアーゼは、動植物由来のものよりも広いpH範囲、温度範囲、耐熱性、耐酸性、耐アルカリ性、基質特異性に優れています。そのため、微生物のβ-マンナナーゼは研究者の間で非常に重要視されています。遺伝子工学的に構築された組換えバクテリアやタンパク質工学的に改変された組換えバクテリアは、様々な面で従来の微生物発酵よりも優れた利点を示すβ-マンナナーゼの生産に広く応用されている。

BACKGROUND: β-mannanase can hydrolyze β-1,4 glycosidic bond of mannan by the manner of endoglycosidase to generate mannan-oligosaccharides. Currently, β-mannanase has been widely applied in food, medicine, textile, paper and petroleum exploitation industries. β-mannanase is widespread in various organisms, however, microorganisms are the main source of β-mannanases. Microbial β-mannanases display wider pH range, temperature range and better thermostability, acid and alkali resistance, and substrate specificity than those from animals and plants. Therefore microbial β-mannanases are highly valued by researchers. Recombinant bacteria constructed by gene engineering and modified by protein engineering have been widely applied to produce β-mannanase, which shows more advantages than traditional microbial fermentation in various aspects.

結果:

腸内細菌から731アミノ酸残基をコードするβ-マンナナーゼ遺伝子（Man1E）をクローニングした。bSiteFinderによる予測では、Man1Eの触媒中心にはTrp166, Trp168, Asn229, Glu230, Tyr281, Glu309, Trp341, Lys374の8つの必須残基が存在することが示された。Man1Eの触媒モジュールと炭水化物結合モジュール(CBM)を相同的にモデル化した。重ね合わせ解析と分子ドッキングにより、Man1Eの触媒モジュールと炭水化物結合モジュールに位置する残基を明らかにした。組換え酵素の発現、精製に成功し、SDS-PAGEにより約82.5kDaを検出した。最適な反応条件は55℃、pH6.5であった。酵素は60℃以下、pH3.5〜8.5の範囲で高い安定性を示した。β-マンナナーゼ活性は、低濃度のCo, Mn, Zn, Ba, Caによって活性化された。Man1Eはローカストビーンガム(LBG)に対して最も高い親和性を示した。LBGのK値は3.09±0.16mg/mL、V値は909.10±3.85μmol/(mLmin)であった。

RESULTS: A β-mannanase gene (Man1E), which encoded 731 amino acid residues, was cloned from Enterobacter aerogenes. Man1E was classified as Glycoside Hydrolase family 1. The bSiteFinder prediction showed that there were eight essential residues in the catalytic center of Man1E as Trp166, Trp168, Asn229, Glu230, Tyr281, Glu309, Trp341 and Lys374. The catalytic module and carbohydrate binding module (CBM) of Man1E were homologously modeled. Superposition analysis and molecular docking revealed the residues located in the catalytic module of Man1E and the CBM of Man1E. The recombinant enzyme was successfully expressed, purified, and detected about 82.5 kDa by SDS-PAGE. The optimal reaction condition was 55 °C and pH 6.5. The enzyme exhibited high stability below 60 °C, and in the range of pH 3.5-8.5. The β-mannanase activity was activated by low concentration of Co, Mn, Zn, Ba and Ca. Man1E showed the highest affinity for Locust bean gum (LBG). The K and V values for LBG were 3.09 ± 0.16 mg/mL and 909.10 ± 3.85 μmol/(mL min), respectively.

結論:

E. aerogenesから高い活性を持つ新しいタイプのβ-マンナナーゼを異種発現させ、特徴付けた。この酵素は未報告のβ-マンナナーゼファミリー（CH1ファミリー）に属する。この酵素は、良好なpHと温度特性を示し、LBGとKGMに対して優れた触媒能を示した。この研究は、その触媒効率と基質特異性を向上させるための将来の応用と分子修飾の基礎を築くものである。

CONCLUSIONS: A new type of β-mannanase with high activity from E. aerogenes is heterologously expressed and characterized. The enzyme belongs to an unreported β-mannanase family (CH1 family). It displays good pH and temperature features and excellent catalysis capacity for LBG and KGM. This study lays the foundation for future application and molecular modification to improve its catalytic efficiency and substrate specificity.