プランタにおける触媒的Cas9/sgRNA複合体を作成するためのsgRNA転写物のネイティブ処理

Native processing of sgRNA transcripts to create catalytic Cas9/sgRNA complexes in planta.

• Will B Cody
• Herman B Scholthof

抄録

シングルガイドRNA（sgRNA）送達のための現在のCRISPR/Cas9遺伝子編集のドグマは、5'および3'ヌクレオチドのオーバーハングが生体内でのCas9/sgRNAの触媒活性を否定するという前提に基づいています。このことから、sgRNAの5'末端および3'末端にある外部ヌクレオチドを回避または除去するように設計された工学的戦略が導かれてきた。以前、我々はタバコモザイクウイルスウイルスベクターを使用して、ニコチアナ・ベンタミアナの単一のウイルス由来のmRNAからGFPとsgRNAの両方を発現させた。このベクターからは，高レベルの GFP と触媒的に活性な sgRNA が得られた．ここで、この結果の生化学的相互作用を理解するための努力として、我々はインビトロアッセイを使用して、sgRNA の近位にある 3'ではなく 5'のヌクレオチドオーバーハングが、実際には指定された標的部位で Cas9 触媒活性を不活性化することを実証した。次に、我々は、プランタにおいて、Cas9に結合したsgRNAが、ウイルスによって転写されると予想される5'オーバーハングを欠いていることを示した。さらに、植物の核プロモーターを用いて GFP-sgRNA 融合転写物を発現させたところ、Cas9 を導入した場合にもインデルが発現した。これらの結果から、植物では前駆体 sgRNA の 5'自己処理がネイティブに行われていることが明らかになりました。この「自動処理」のメカニズムを探るために、in vitro で生成された RNA と植物から単離された RNA を用いて、5' から 3' エキソリボヌクレアーゼ XRN1 が伸長した前駆体 sgRNA を分解できるのに対し、成熟した sgRNA 末端生成物は耐性を持つことを発見した。他の研究との比較から、sgRNAの「自動処理」は植物に特有の現象ではなく、他の真核生物にも存在する可能性が示唆された。

The current CRISPR/Cas9 gene editing dogma for single guide RNA (sgRNA) delivery is based on the premise that 5'- and 3'-nucleotide overhangs negate Cas9/sgRNA catalytic activity in vivo. This has led to engineering strategies designed to either avoid or remove extraneous nucleotides at the 5' and 3' termini of sgRNAs. Previously, we used a Tobacco mosaic virus viral vector to express both GFP and a sgRNA from a single virus-derived mRNA in Nicotiana benthamiana. This vector yielded high levels of GFP and catalytically active sgRNAs. Here, in an effort to understand the biochemical interactions of this result, we used in vitro assays to demonstrate that nucleotide overhangs 5', but not 3', proximal to the sgRNA do in fact inactivate Cas9 catalytic activity at the specified target site. Next we showed that in planta sgRNAs bound to Cas9 are devoid of the expected 5' overhangs transcribed by the virus. Furthermore, when a plant nuclear promoter was used for expression of the GFP-sgRNA fusion transcript, it also produced indels when delivered with Cas9. These results reveal that 5' "auto-processing" of progenitor sgRNAs occurs natively in plants. Towards a possible mechanism for the perceived "auto-processing", we found, using in vitro-generated RNAs and those isolated from plants, that the 5' to 3' exoribonuclease XRN1 can degrade elongated progenitor sgRNAs whereas the mature sgRNA end products are resistant. Comparisons with other studies suggest that sgRNA "auto-processing" may be a phenomenon not unique to plants, but present in other eukaryotes as well.

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