定量的モデル誘導突然変異誘発法を用いて、全長CXCR4-CXCL12複合体の機能解剖を系統的に行った

Functional anatomy of the full-length CXCR4-CXCL12 complex systematically dissected by quantitative model-guided mutagenesis.

• Bryan S Stephens
• Tony Ngo
• Irina Kufareva
• Tracy M Handel

抄録

ケモカイン受容体CXCR4とそのリガンドCXCL12は、発生、がん、HIVなどで重要な役割を果たしていることから、多くの構造・機能研究が行われてきたが、リガンドの結合、選択性、シグナル伝達の決定因子については、まだ十分に理解されていない。ここでは、我々の最新の構造モデルに基づき、系統的な突然変異誘発戦略を用いて、CXCR4-CXCL12複合体の機能解剖を行った。主要な電荷スワップ突然変異誘発実験により、受容体とケモカインの反対電荷残基間のペアワイズ相互作用の証拠が得られ、受容体に対するケモカインの配向予測の正確性が確認され、リガンドの選択性についての洞察が得られた。N末端残基を段階的に削除することで、ケモカインのシグナル伝達に受容体のN末端が予想外に寄与していることが明らかになった。この発見は、N末端が結合親和性にのみ寄与しているという、受容体とケモカインの相互作用の本質的な特徴に関する長年の「2サイト」仮説に挑戦するものである。我々の結果は、ケモカインのN末端と受容体結合ポケットとの相互作用がシグナル伝達の鍵となるが、シグナル伝達の振幅は、受容体のN末端がケモカインと結合する程度に依存することを示唆している。他のエピトープの系統的な特徴付けと合わせて、これらのデータは、CXCL12がCXCR4とどのように結合し、受容体膜貫通ドメインを介してシグナル伝達を開始するかについて、実験的に一貫した構造モデルを提案することを可能にしている。

Because of their prominent roles in development, cancer, and HIV, the chemokine receptor CXCR4 and its ligand CXCL12 have been the subject of numerous structural and functional studies, but the determinants of ligand binding, selectivity, and signaling are still poorly understood. Here, building on our latest structural model, we used a systematic mutagenesis strategy to dissect the functional anatomy of the CXCR4-CXCL12 complex. Key charge swap mutagenesis experiments provided evidence for pairwise interactions between oppositely charged residues in the receptor and chemokine, confirming the accuracy of the predicted orientation of the chemokine relative to the receptor and providing insight into ligand selectivity. Progressive deletion of N-terminal residues revealed an unexpected contribution of the receptor N terminus to chemokine signaling. This finding challenges a longstanding "two-site" hypothesis about the essential features of the receptor-chemokine interaction in which the N terminus contributes only to binding affinity. Our results suggest that although the interaction of the chemokine N terminus with the receptor-binding pocket is the key driver of signaling, the signaling amplitude depends on the extent to which the receptor N terminus binds the chemokine. Together with systematic characterization of other epitopes, these data enable us to propose an experimentally consistent structural model for how CXCL12 binds CXCR4 and initiates signal transmission through the receptor transmembrane domain.

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