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発生研究のための精子RNA処理の最適化
Optimization of sperm RNA processing for developmental research.
PMID: 32665575 PMCID: PMC7360572. DOI: 10.1038/s41598-020-68486-1.
抄録
近年の研究では、精子RNAが生命の行方を左右する重要な情報のトランスポーターとして機能することの意義が明らかになってきました。精子RNAに含まれるメッセージを決定するためには、トランスクリプトーム研究ツールの最適化が必要である。本研究では、精子 RNA のサンプル保存から定量的リアルタイム PCR までの処理を最適化し、男性の妊孕性とその代表的なマーカーである equatorin (EQTN) と peroxiredoxin (PRDX) の評価に対応する方法を評価しました。定量的リアルタイムPCR実験公開のためのミニマム情報ガイドラインに沿って、イノシシの精子を用いていくつかの方法を比較した。最適化された手順を評価するために、精子中のEQTNとPRDXのmRNA発現と20頭のイノシシの受胎可能性（産卵サイズ）との関係を評価した。意外なことに、RNA単離中のDNase処理は、RNA濃度を56％低下させ、EQTNおよびPRDX4のmRNA発現と雄の受胎率との相関を排除するという劇症的な効果を有していた。さらに、対応する方法で精子RNAを処理したところ、エクソン配列の発現量、男性の妊孕性予測力、一貫性が最も高い結果が得られた。このように男性の受胎可能性を予測するために最適化されたプロトコルは、精子から子孫へのライフコースを指示するメッセージの輸送を研究するために利用することができます。
Recent studies have demonstrated the significance of sperm RNA function as a transporter of important information directing the course of life. To determine the message contained in sperm RNA, it is necessary to optimize transcriptomic research tools. The current study was performed to optimize the processing of sperm RNA from sample storage to quantitative real-time PCR and assess the corresponding method with to evaluate male fertility and its representative markers, equatorin (EQTN) and peroxiredoxin (PRDX). Following successive steps of the Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments guidelines, several options were compared using boar spermatozoa. To evaluate the optimized procedures, the relationship between mRNA expression of EQTN and PRDX in spermatozoa and the fertility (litter size) of 20 individual boars was assessed. Unexpectedly, DNase treatment during RNA isolation had the deleterious effect by decreasing the RNA concentration by 56% and eliminating the correlation between EQTN and PRDX4 mRNA expression and male fertility. Moreover, when sperm RNA was processed using the corresponding method, the results showed the highest exon sequence expression, male fertility prediction power, and consistency. This optimized protocol for predicting male fertility can be used to study the transport of messages directing the life course from spermatozoon to offspring.