コラーゲンをベースとした二次元足場上のASCの脂肪原性分化能の組織学的検証

Histological validation of adipogenic differentiation potential of ASC on collagen-based 2D scaffolds.

• Marta Gomarasca
• Paolo Savadori
• Sara Mariano
• Laura Cipolla
• Giovanni Lombardi

抄録

脂肪由来間葉系幹細胞/幹細胞（ASC）の脂肪形成能と挙動の決定は、再生医療における潜在的な臨床応用、特に再生が生体材料や足場によって支持されている場合に特に関連している。足場は、組織修復を誘導し、望ましくない脂肪原性分化を制限することができる必要がある。採用される足場によっては、細胞の挙動の決定は、染色に対する材料の干渉によって妨げられることがあり、細胞の同定または色素の定量化のいずれかを制限することになる。コラーゲンは、再生医療における有望な生体材料であるが、コラーゲンベースの足場上で培養された細胞の組織学的分析は困難である。ここでは、コラーゲンベースの2D足場上で培養したASCの脂肪原性分化を決定するために、オイルレッドO（ORO）染色と組み合わせた鉄ヘマトキシリンに基づく新しい組織学的手法を説明します。コラーゲンフィルムまたはプラスチック上にASCを播種し、14日間脂肪細胞に分化させた後、ORO染色または鉄ヘマトキシリンとOROを組み合わせた染色を行った。コラーゲンフィルムは ORO 色素を貪欲に吸収し、従来の染色や色素抽出による定量では、フィルム上の分化した細胞と未分化細胞の区別がつかなかった。逆に、鉄ヘマトキシリンとOROの組み合わせでは、単一細胞数に基づく脂肪細胞の定量的かつ信頼性の高い判定が可能となった。この方法は、バイオエンジニアリングや再生医療での使用の可能性を検証する必要がある高吸収性材料上で成長したASCやその他の細胞タイプの脂肪原性分化能を決定するために特に推奨されます。

Determination of the adipogenic potential and behavior of adipose-derived mesenchymal stem/stromal cells (ASCs) is particularly relevant for their potential clinical application in regenerative medicine, especially when regeneration is supported by biomaterials or scaffolds. Scaffolds need to be able to induce tissue repair and limit undesired adipogenic differentiation. Depending on the scaffold employed, determination of cell behavior may be hindered by material interference with staining, which will limit either cells identification or dye quantification. Collagen is a promising biomaterial in regenerative medicine, however, histological analysis of cells cultured on collagen-based scaffolds is challenging. Here we describe a new histological method based on iron hematoxylin combined with Oil red O (ORO) staining, for the determination of the adipogenic differentiation of ASCs cultivated on a collagen-based 2D scaffold. ASCs were seeded on collagen films or plastic, differentiated into adipocytes for 14 days, and then stained with either ORO or iron hematoxylin and ORO combined. The collagen films avidly absorbed the ORO dye; conventional staining and quantification by dye extraction failed to discriminate between differentiated and undifferentiated cells on the films. On the contrary, the iron hematoxylin-ORO combination provided a quantitative and more reliable determination of adipocytes based on single cell count. This method is particularly recommended for determining the adipogenic differentiation potential of ASCs and other cell types grown on highly absorptive materials that need to be validated for their potential use in bioengineering and regenerative medicine.