BRAF(V600E)変異を有する甲状腺癌細胞において、過剰なオートファジーを制御することにより、HMGB1がベムラフェニブ抵抗性に関与していることを明らかにした

Involvement of HMGB1 in vemurafenib resistance in thyroid cancer cells harboring BRAF (V600E) mutation by regulating excessive autophagy.

• Lin Run
• Liping Wang
• Xiting Nong
• Nan Li
• Xin Huang
• Yang Xiao

抄録

目的:

甲状腺がんは、BRAFV600E変異の発生頻度が最も高い内分泌系悪性腫瘍である。BRAFV600Eの特異的阻害剤であるベムラフェニブによる標的治療は、治療の大きな進歩を遂げていますが、抵抗性の発生は依然として臨床上の課題となっています。ここで我々は、BRAF変異を有する甲状腺癌におけるベムラフェニブ抵抗性における高移動度グループボックス1（HMGB1）の機能を明らかにしようとした。

PURPOSE: Thyroid carcinoma is the most frequent endocrine malignancy with high occurrence of BRAFV600E mutations. Though targeted therapy by vemurafenib, a specific inhibitor for BRAFV600E, has achieved great advance in therapeutic landscape, resistance occurrence is still a clinical challenge. Here, we sought to elucidate the function of high mobility group box 1 (HMGB1) in vemurafenib resistance in thyroid cancer harboring BRAF mutation.

方法:

BRAF変異体BCPAP細胞およびBRAF野生型CAL-62細胞におけるHMGB1の発現をqRT-PCRおよびウエスタンにより決定した。次に、BCPAP細胞を組換えHMGB1プラスミドでトランスフェクトし、ベムラフェニブ耐性BCPAP-R細胞をsi-HMGB1で処理した。HMGB1のベムラフェニブ耐性に対する有効性は、細胞生存率、アポトーシス、カスパーゼ-3活性を検出することにより評価した。また，オートファジー経路の関与についても検討した．

METHODS: The expression of HMGB1 in BRAF-mutant BCPAP and BRAF-wild CAL-62 cells were determined by qRT-PCR and western. Then, BCPAP cells were transfected with recombinant HMGB1 plasmids, and vemurafenib-resistant BCPAP-R cells were treated with si-HMGB1. The efficacy of HMGB1 on vemurafenib resistance was evaluated by detecting cell viability, apoptosis, and caspase-3 activity. In addition, the involvement of autophagy pathway was investigated.

結果:

その結果、ベムラフェニブに対する感受性が高いBRAF変異体BCPAP細胞ではHMGB1の発現が低下していた。HMGB1の過剰発現は、細胞の生存率を高め、細胞のアポトーシスやカスパーゼ-3活性を低下させることで、ベムラフェニブに対するBCPAP細胞の感受性を低下させた。興味深いことに、ベムラフェニブ耐性BCPAP-R細胞ではHMGB1の高発現が確認された。さらに、HMGB1のノックダウンは、ベムラフェニブ耐性BCPAP-R細胞を感作した。メカニズム的には、ベムラフェニブ曝露はLC3II、Beclin-1発現を増強し、オートファジー基質であるp62発現を低下させることでオートファジーを誘導した。重要なことは、HMGB1を標的とすることで、ベムラフェニブ誘発オートファジーが抑制されたことである。阻害剤3-MAでオートファジー経路をブロックすることで、BCPAP-R細胞のベムラフェニブに対する抵抗性が相殺された。

RESULTS: Lower expression of HMGB1 was observed in BRAF-mutant BCPAP cells that had high sensitivity to vemurafenib. Overexpression of HMGB1 attenuated BCPAP cell sensitivity to vemurafenib by increasing cell viability and decreasing cell apoptosis and caspase-3 activity. Intriguingly, higher expression of HMGB1 was confirmed in vemurafenib-resistant BCPAP-R cells. Moreover, knockdown of HMGB1 sensitized BCPAP-R cells to vemurafenib resistance. Mechanistically, vemurafenib exposure induced autophagy by enhancing LC3II, Beclin-1 expression, and reducing autophagy substrate p62 expression. Importantly, targeting HMGB1 suppressed vemurafenib-induced autophagy. Blocking autophagy pathway with its inhibitor 3-MA offset BCPAP-R cell resistance to vemurafenib.

結論:

これらの知見は、HMGB1が介在するオートファジーが、BRAF変異を有する甲状腺癌におけるベムラフェニブ抵抗性の原因となっている可能性を強調しており、ベムラフェニブ変異を有する甲状腺癌におけるベムラフェニブ抵抗性を克服するための有望なアプローチを示唆している。

CONCLUSIONS: These findings highlight that HMGB1-mediated autophagy may account for vemurafenib resistance in thyroid cancer harboring BRAF mutation, implying a promising approach to overcome vemurafenib resistance in vemurafenib-mutant thyroid carcinomas.