イムノアフィニティマイクロフロー液体クロマトグラフィー/タンデム質量分析法によるヒト腫瘍組織中のPD1およびPD-L1の定量

Immunoaffinity Micro-Flow Liquid Chromatography/Tandem Mass Spectrometry for the Quantitation of PD1 and PD-L1 in Human Tumor Tissues.

• Yongxin Zhu
• Jacob Zalaznick
• Bogdan Sleczka
• Karen Parrish
• Zheng Yang
• Timothy Olah
• Petia Shipkova

抄録

ラショナル:

PD1およびPD-L1の高い腫瘍発現は、抗PD1剤または抗PD-L1剤による治療後の良好な臨床転帰と関連していると考えられています。PD1およびPD-L1発現の測定を含む、IHC、LBAおよびLCMSに基づくいくつかの感度の高い方法が報告されている。ここでは、腫瘍組織中のPD1およびPD-L1の同時定量のための高特異性、高感度、および堅牢なイムノアフィニティLC/MS/MSベースの方法を使用して、異なるタイプの腫瘍の特徴付けを拡大する。

RATIONALE: High tumor expression of PD1 and PD-L1 is thought to be associated with positive clinical outcomes after treatment with anti-PD1 or anti-PD-L1 agents. Several sensitive methods based on IHC, LBA, and LCMS involving the measurement of PD1 and PD-L1 expression have been reported. Here we expand on the characterization of different tumor types using a highly specific, sensitive, and robust immunoaffinity LC/MS/MS-based method for the simultaneous quantitation of PD1 and PD-L1 in tumor tissues.

方法:

ヒト腫瘍組織サンプルは、Precellys Evolution Homogenizerでホモジナイズしました。サンプルは、磁気ビーズに結合した抗PD1および抗PD-L1キャプチャーポリクローナル抗体でインキュベートしました。濃縮後、サンプルをトリプシンで消化した。クロマトグラフィー分離にはウォーターズ社製iKEY HSS T3 1.8 um (150 μm x 100 mm)カラムを、検出にはウォーターズ社製TQ-Sトリプル四重極質量分析計を使用しました。前駆体/生成物イオン質量の単位分解能を持つ選択反応モニタリング(SRM)トランジションをPD1とPD-L1サロゲートペプチドに対して最適化しました。

METHOD: Human tumor tissue samples were homogenized by a Precellys Evolution Homogenizer. The samples were incubated with anti-PD1 and anti-PD-L1 capture polyclonal antibodies which were bound to magnetic beads. Following enrichment, samples were digested with trypsin. A Waters iKEY HSS T3 1.8 um (150 μm x 100 mm) column with a gradient flow rate of 3 μL/min was used for chromatographic separation and a Waters TQ-S triple quadrupole mass spectrometer was used for detection. Selected reaction monitoring (SRM) transitions with unit resolution for precursor/product ion masses were optimized for PD1 and PD-L1 surrogate peptides.

結果:

PD1のサロゲートペプチドLAAFPEDRおよびPD-L1のFTVTVPKは、それぞれm/z 459.7 > 516.2およびm/z 396.2 > 543.3で最も強いSRM転移を示したため、PD1およびPD-L1の定量に選択した。PD1およびPD-L1の定量下限は0.062 ng/mLであり、アッセイ範囲は10 ng/mLまでであった。この方法を用いて、4種類の異なる腫瘍組織からヒトPD1およびPD-L1を検出し、定量した。このデータは、ここで解析したすべての腫瘍組織において、PD1の発現レベルがPD-L1の発現レベルと高い相関性を示していることを示しています。

RESULTS: The surrogate peptides LAAFPEDR for PD1 and FTVTVPK for PD-L1 yielded the most intense SRM transitions at m/z 459.7 > 516.2 and m/z 396.2 > 543.3, respectively, and thus were selected for the quantitation of PD1 and PD-L1. The lower limit of quantitation for PD1 and PD-L1 was 0.062 ng/mL with an assay range up to 10 ng/mL. Using this method, human PD1 and PD-L1 were detected and quantified from four different types of tumor tissues. The data shows that PD1 expression level was highly correlated with that of PD-L1 in all tumor tissues analyzed here.

結論:

腫瘍組織中のPD1とPD-L1の同時定量のための高特異性かつ高感度なイムノアフィニティマイクロフローLC/MS/MS法を開発し、実施した。この方法は、分析物濃縮のためのイムノキャプチャーの利点と、LC/MS/MSによる複数のサロゲートペプチドの高特異性の検出を組み合わせたものである。腫瘍におけるPD1とPD-L1の共発現の定量化は、腫瘍のタイプ選択と患者の層別化の評価におけるそれらの役割を評価するのに役立つ可能性がある。

CONCLUSIONS: A highly specific and sensitive immunoaffinity micro-flow LC/MS/MS method for the simultaneous quantification of PD1 and PD-L1 in tumor tissues was developed and implemented. This method combines the advantage of immuno-capture for analyte enrichment with the high specificity of detection of multiple surrogate peptides by LC/MS/MS. The quantification of PD1 and PD-L1 co-expression in tumor could help evaluate their role in assessing tumor type selection and patient stratification.

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