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FMDV Lproの異なるタンパク質分解活性の解剖は、タイプIインターフェロン抑制において、そのdeISGylase/DUB活性ではなく、RLRシグナル伝達タンパク質の切断と分解を示唆している
Dissecting distinct proteolytic activities of FMDV Lpro implicates cleavage and degradation of RLR signaling proteins, not its deISGylase/DUB activity, in type I interferon suppression.
PMID: 32667958 DOI: 10.1371/journal.ppat.1008702.
抄録
タイプIインターフェロン応答は、重要な生得的抗ウイルス経路である。RIG-I様受容体（RLR）によるウイルスRNAの認識は、I型インターフェロン（IFN-α/β）遺伝子の転写を導くシグナル伝達カスケードを活性化する。このシグナル伝達経路の複数のタンパク質（例：RIG-I、MDA5、MAVS、TBK1、IRF3）は、（脱）ユビキチン化イベントによって制御されている。ほとんどのウイルスは、この抗ウイルス応答に対抗するメカニズムを進化させてきた。口蹄疫ウイルス（FMDV）のリーダープロテアーゼ（Lpro）は、IFN-α/β遺伝子の転写を減少させることが認識されているが、正確なメカニズムは不明である。Lpro のタンパク質分解活性は、ウイルスポリプロテインからの放出、および eIF4G や NF-κB などの特定の宿主細胞タンパク質の切断・分解に不可欠である。さらに、Lproは脱ユビキチン化/脱ISGylation活性を有することが実証されています。Lproの脱ユビキチン化/脱ISGylation活性とシグナル伝達タンパク質の切断/分解は、いずれもIFN-α/β遺伝子の転写抑制に重要であると考えられています。ここでは、転写因子IRF3をリン酸化し活性化するキナーゼであるTBK1が、FMDV感染細胞およびLproを発現する組換えEMCV感染細胞において、Lproによって切断されることを示した。In vitroでの開裂実験により、LproはTBK1を残基692-694で開裂することが明らかになった。また、EMCV-Lproに感染したHeLa細胞ではMAVSの切断が観察されたが、FMDV感染したブタのLFPKαVβ6細胞ではMAVSのレベルが低下していることが確認されただけであった。我々は、IFN-α/β遺伝子転写の減少に対するそれらの相対的な寄与を決定するために、RLRシグナル伝達タンパク質を切断するLproの能力を、その脱ユビキチン化/脱ISGylation活性から解剖することに着手した。特定の変異を導入することにより、そのうちのいくつかは、最近発表されたISG15との複合体におけるLproの構造に基づいており、Lproの異なるタンパク質分解活性を分離する特定のアミノ酸置換を同定することができました。これらの変異の効果の特性化は、RLRシグナル伝達タンパク質を切断するLproの能力が、その脱ユビキチン化/脱ISGylation活性ではなく、IFN-β遺伝子の転写の減少と相関していることを明らかにした。
The type I interferon response is an important innate antiviral pathway. Recognition of viral RNA by RIG-I-like receptors (RLRs) activates a signaling cascade that leads to type I interferon (IFN-α/β) gene transcription. Multiple proteins in this signaling pathway (e.g. RIG-I, MDA5, MAVS, TBK1, IRF3) are regulated by (de)ubiquitination events. Most viruses have evolved mechanisms to counter this antiviral response. The leader protease (Lpro) of foot-and-mouth-disease virus (FMDV) has been recognized to reduce IFN-α/β gene transcription; however, the exact mechanism is unknown. The proteolytic activity of Lpro is vital for releasing itself from the viral polyprotein and for cleaving and degrading specific host cell proteins, such as eIF4G and NF-κB. In addition, Lpro has been demonstrated to have deubiquitination/deISGylation activity. Lpro's deubiquitination/deISGylation activity and the cleavage/degradation of signaling proteins have both been postulated to be important for reduced IFN-α/β gene transcription. Here, we demonstrate that TBK1, the kinase that phosphorylates and activates the transcription factor IRF3, is cleaved by Lpro in FMDV-infected cells as well as in cells infected with a recombinant EMCV expressing Lpro. In vitro cleavage experiments revealed that Lpro cleaves TBK1 at residues 692-694. We also observed cleavage of MAVS in HeLa cells infected with EMCV-Lpro, but only observed decreasing levels of MAVS in FMDV-infected porcine LFPK αVβ6 cells. We set out to dissect Lpro's ability to cleave RLR signaling proteins from its deubiquitination/deISGylation activity, to determine their relative contributions to the reduction of IFN-α/β gene transcription. The introduction of specific mutations, of which several were based on the recently published structure of Lpro in complex with ISG15, allowed us to identify specific amino acid substitutions that separate the different proteolytic activities of Lpro. Characterization of the effects of these mutations revealed that Lpro's ability to cleave RLR signaling proteins but not its deubiquitination/deISGylation activity correlates with the reduced IFN-β gene transcription.