抗てんかん薬であるバルプロ酸は、ゼブラフィッシュ幼虫の発育中の頭蓋顔面骨格に奇形を生じさせます

The anti-epileptic drug valproic acid causes malformations in the developing craniofacial skeleton of zebrafish larvae.

• I G E Gebuijs
• J R Metz
• J Zethof
• C E L Carels
• F A D T G Wagener
• J W Von den Hoff

抄録

バルプロ酸（VPA）は抗てんかん薬であり、口腔裂（OFC）を含む先天性の頭蓋顔面異常を引き起こすことが知られています。VPAが頭蓋顔面骨格奇形を引き起こす正確なメカニズムはよくわかっていません。本研究では、ゼブラフィッシュ幼生頭部の軟骨と骨形成に及ぼすVPAの影響を、頭蓋神経堤細胞（CNCC）が発生し、増殖・分化する1～13 hpf（初期）と25～37 hpf（後期）に分けて検討しました。5 dpf時の軟骨と骨の二重染色を行ったところ、VPAは初期または後期の両方の曝露後に用量依存的に軟骨と骨の形成を減少させることが明らかになった。CNCC由来のいくつかの異なる軟骨と骨の要素が両群で影響を受けた。初期群（100μM VPA）では、後頭部の長さと舟状板の長さが減少し（いずれもp<0.01）、9つの骨要素のうち4つの骨要素のミネラル化が欠落していた（いずれもp<0.01）。後期群（100μM VPA）では、後頭部の長さが減少し、大脳骨の長さも減少した（いずれもp<0.01）。初期暴露と同様に、9つの骨要素のうち3つの骨要素のミネラル化はしばしば欠落していた（いずれもp<0.01）。これらの結果は、CNCCの形成（初期）と分化（後期）の両方がVPA処理によって妨げられていることを示しており、そのうちの骨と軟骨の形成への影響は5 dpfで持続しています。また、軟骨と骨に関連するいくつかの遺伝子の発現が5dpfでアップレギュレーションされていることも明らかになった。これらのデータは、軟骨と骨の不足に対する代償的な反応を示しています。以上のことから、VPAはCNCC機能の障害を介して頭蓋顔面奇形を誘発し、軟骨と骨の形成不全を引き起こすと考えられます。

Valproic acid (VPA) is an anti-epileptic drug known to cause congenital craniofacial abnormalities, including orofacial clefts (OFC). The exact mechanisms by which VPA leads to craniofacial skeletal malformations are poorly understood. In this study, we investigated the effects of VPA on cartilage and bone formation in the zebrafish larval head during 1-13 hpf (early) and 25-37 hpf (late) development in which cranial neural crest cells (CNCCs) arise and then proliferate and differentiate, respectively. Double-staining for cartilage and bone at 5 dpf revealed that VPA reduced cartilage and bone formation in a dose-dependent manner after both early or late exposure. Several different CNCC-derived cartilage and bone elements were affected in both groups. In the early group (100 μM VPA), the posterior head length and the ethmoid plate were reduced in length (both p < 0.01), while mineralization of 4 out of 9 bone elements was often lacking (all p < 0.01). In the late group (100 μM VPA), also the posterior head length was reduced as well as the length of the ceratohyals (both p < 0.01). Similar to early exposure, mineralization of 3 out of 9 bone elements was often lacking (all p < 0.01). These results indicate that both CNCC formation (early) and differentiation (late) are hampered by VPA treatment, of which the consequences for bone and cartilage formation are persistent at 5 dpf. Indeed, we also found that the expression of several genes related to cartilage and bone was upregulated at 5 dpf. These data indicate a compensatory reaction to the lack of cartilage and bone. Altogether, VPA seems to induce craniofacial malformations via disturbed CNCC function leading to defects in cartilage and bone formation.

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