セリアック病の病原性ペプチドに対する加水分解活性を向上させたスフィンゴモナス・カプシュラータ由来のプロリルエンドペプチダーゼを合理的に設計した

Rationally engineered prolyl endopeptidases from Sphingomonas capsulata with improved hydrolytic activity towards pathogenic peptides of celiac diseases.

• Bin Xiao
• Chun Zhang
• Xiaotong Song
• Miao Wu
• Jianping Mao
• Rong Yu
• Yongxiang Zheng

抄録

セリアック病は人口の約1％が罹患しており、世界的にも大きな公衆衛生上の問題となっています。セリアック病の引き金となるのは、グルテン由来のペプチドで、プロリン・グルタミンモチーフの含有量が異常に高く、消化管の消化酵素によるタンパク質分解に非常に強いという特徴があります。セリアック病の唯一の治療法は、グルテンフリーの食事を生涯にわたって厳守することであるが、効果的ではあるが、費用がかかり、維持することが難しい。したがって、セリアック病のための新しい非食事療法が緊急に必要とされている。グルテン分解酵素は有望な非食事療法であり、いくつかの酵素は前臨床試験または臨床試験で研究されている。Sphingomonas capsulata（SC PEP）由来のプロリルエンドペプチダーゼとラティグルテナーゼとして知られるグルタミン特異的エンドプロテアーゼ（大麦由来のEP-B2）の組み合わせは、第II相臨床試験では不十分な効果を示したが、これはおそらく胃内環境での酵素活性が低いためであろう。したがって、SC PEPの臨床応用には酵素活性の向上が不可欠である。酵素活性は、コンピュータ支援による合理的なタンパク質設計ツールを用いて向上させることができる。本研究では、分子ドッキングと分子動力学シミュレーションを組み合わせて SC PEP 変異体を合理的に設計し、その活性を実験的に評価した。その結果、特異的活性が最大 90～103%向上し、触媒率が最大 80～202%向上する変異体を同定した。その結果、SC PEPのβ-プロペラドメインと触媒ドメインの構造変化が酵素活性に重要であり、この構造変化は触媒ドメインとドメイン界面の残基の影響を受け、基質Proとオキシアニオンホールの距離が短くなることもSC PEPの触媒活性向上に重要であることを明らかにした。我々の結果は、セリアック病の酵素治療薬候補の開発を加速するために、高活性SC PEPを合理的に設計するための有用な情報を提供している。

Celiac disease affects approximately 1% of the population and is a major public health problem worldwide. It is trigged by gluten-derived peptides, which have unusually high proline-glutamine motif content and are highly resistant to proteolysis by digestive enzymes of the gastrointestinal tract. The only treatment for celiac disease is strict, lifelong adherence to a gluten-free diet, which is effective but costly and difficult to maintain. Therefore, novel non-dietary therapies for celiac disease are urgently needed. Gluten-degrading enzymes are promising non-dietary treatments, and some enzymes have been investigated in preclinical or clinical studies. A combination of prolyl endopeptidase from Sphingomonas capsulata (SC PEP) and a glutamine-specific endoprotease (EP-B2 from barley) known as latiglutenase showed insufficient benefits in phase II clinical trials, likely because of its low enzyme activity in the gastric environment. Therefore, improving enzyme activity is essential for the clinical application of SC PEP. Enzyme activity can be enhanced using computer-aided rational protein design tools. In this study, we combined molecular docking and molecular dynamics simulation to rationally design SC PEP mutants and experimentally evaluated their activities. We identified mutants with up to 90-103% increases in specific activity and up to 80-202% increases in the catalytic rate. We have investigated the mechanism underlying the enhanced activity of these mutants, and found that a conformational transition of the β-propeller domain and catalytic domain of SC PEP was important for enzyme activity, and this transition was affected by residues in the catalytic domain and at the domain interface; a shorter distance between the substrate Pro and the oxyanion holes was also crucial for improving SC PEP catalytic activity. Our results provide useful information for the rational design of highly active SC PEPs to accelerate the development of enzyme therapeutics candidates for Celiac disease.

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