MS2-ADARを用いたサイト指示型RNA編集のためのシングルコンストラクトシステムの開発

Development of a Single Construct System for Site-Directed RNA Editing Using MS2-ADAR.

• Tetsuto Tohama
• Matomo Sakari
• Toshifumi Tsukahara

抄録

サイト指示型RNA編集（SDRE）技術は、点突然変異に起因する遺伝性疾患の治療に大きな可能性を秘めています。私たちのグループをはじめとする研究者たちは、RNAに作用するアデノシンデアミナーゼ（ADAR）とADARをリクルートするガイドRNAを利用して、点変異を持つRNAを標的とするSDRE法を開発してきました。一般に、効率的なSDREは、標的遺伝子に対して多数のガイドRNAを導入することに依存している。しかし、大きな比率を達成することは、遺伝子治療用途では不可能である。そこで、本研究では、ADAR フラグメントからなる融合タンパク質と各遺伝子を 1 コピーしたプラスミドベクターを用いて、同数の遺伝子とガイド RNA を培養細胞に導入することができるシステムを開発した。この単一コンストラクトをHEK293T細胞にトランスフェクションしたところ、比較的高い効率（最大42％）を達成した。この結果は、3つの因子（標的遺伝子、ガイドRNA、ADAR酵素）のコピー数がすべて同じであれば、効率的なSDREが可能であることを示している。この方法は、高効率な遺伝子修復が可能であり、遺伝子治療への応用が期待されます。

Site-directed RNA editing (SDRE) technologies have great potential for treating genetic diseases caused by point mutations. Our group and other researchers have developed SDRE methods utilizing adenosine deaminases acting on RNA (ADARs) and guide RNAs recruiting ADARs to target RNAs bearing point mutations. In general, efficient SDRE relies on introducing numerous guide RNAs relative to target genes. However, achieving a large ratio is not possible for gene therapy applications. In order to achieve a realistic ratio, we herein developed a system that can introduce an equal number of genes and guide RNAs into cultured cells using a fusion protein comprising an ADAR fragment and a plasmid vector containing one copy of each gene on a single construct. We transfected the single construct into HEK293T cells and achieved relatively high efficiency (up to 42%). The results demonstrate that efficient SDRE is possible when the copy number is similar for all three factors (target gene, guide RNA, and ADAR enzyme). This method is expected to be capable of highly efficient gene repair , making it applicable for gene therapy.