ユビキチンリガーゼSMURF2は上皮成長因子受容体の安定性とチロシンキナーゼ阻害剤耐性を高める

Ubiquitin ligase SMURF2 enhances epidermal growth factor receptor stability and tyrosine-kinase inhibitor resistance.

• Paramita Ray
• Krishnan Raghunathan
• Aarif Ahsan
• Uday Sankar Allam
• Shirish Shukla
• Venkatesha Basrur
• Sarah Veatch
• Theodore S Lawrence
• Mukesh K Nyati
• Dipankar Ray

抄録

活性化性上皮成長因子受容体（EGFR）変異の発見は、肺癌の第一選択治療薬としてエルロチニブなどのEGFRチロシンキナーゼ阻害薬（TKI）の使用に拍車をかけた。我々は以前、エルロチニブ投与時にTKI感受性（L858Rなど）と耐性（T790M）のEGFR変異体の分解が薬剤感受性と相関していることを報告した。また、SMADユビキチン化調節因子2（SMURF2）リガーゼ活性がEGFRの安定化に重要であることを報告した。しかし、その分子機構は不明な点が多い。ここでは、インビトロおよびインビボのユビキチン化アッセイ、質量分析、超解像顕微鏡を用いて、SMURF2-EGFRの機能的相互作用がEGFRの安定性とTKIに対する応答に重要であることを示した。我々は、L858R/T790M EGFRがSMURF2-UBCH5（E3-E2）を介したポリユビキチン化によって優先的に安定化されることを実証した。その結果、4つのリジン残基をユビキチン化部位として同定し、そのうちの1つをアセチル化を模倣したグルタミンで置換することで、変異型EGFRのエルロチニブ誘発分解に対する感受性が向上することを示した。SMURF2のノックダウンはリソソームへの受容体の選別を増加させるのに対し、SMURF2はEGFに結合したEGFRの膜保持を拡張させることを示した。肺癌細胞株では、SMURF2の過剰発現はEGFRレベルを上昇させ、TKI耐性を向上させた。以上のことから、SMURF2を介したL858R/T790M EGFRのポリユビキチン化は、アセチル化を介した受容体の内在化と競合している可能性が示唆され、E3-E2複合体の破壊はTKI耐性を克服するための魅力的なターゲットとなり得る。

The discovery of activating epidermal growth factor receptor (EGFR) mutations spurred the use of EGFR tyrosine kinase inhibitors (TKIs), such as erlotinib, as the first-line treatment of lung cancers. We previously reported that differential degradation of TKI-sensitive (e.g. L858R) and resistant (T790M) EGFR mutants upon erlotinib treatment correlates with drug sensitivity. We also reported that SMAD ubiquitination regulatory factor 2 (SMURF2) ligase activity is important in stabilizing EGFR. However, the molecular mechanisms involved remain unclear. Here, using in vitro and in vivo ubiquitination assays, mass spectrometry, and super-resolution microscopy, we show SMURF2-EGFR functional interaction is important for EGFR stability and response to TKI. We demonstrate that L858R/T790M EGFR is preferentially stabilized by SMURF2-UBCH5 (an E3-E2) mediated polyubiquitination. We identified four lysine residues as the sites of ubiquitination, and showed that replacement of one of them with acetylation-mimicking glutamine increases the sensitivity of mutant EGFR to erlotinib-induced degradation. We show that SMURF2 extends membrane retention of EGF bound EGFR, whereas SMURF2 knockdown increases receptor sorting to lysosomes. In lung cancer cell lines, SMURF2 overexpression increased EGFR levels, improving TKI tolerance, while SMURF2 knockdown decreased EGFR steady state levels and sensitized lung cancer cells. Overall, we propose that SMURF2-mediated polyubiquitination of L858R/T790M EGFR may be competing with acetylation-mediated receptor internalization that correlates with enhanced receptor stability, therefore, disruption of the E3-E2 complex may be an attractive target to overcome TKI resistance.

Published under license by The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.