膀胱上皮細胞の細胞骨格の変化を引き起こし、非リソソーム液胞形成を誘導する液胞化オートトランスポーター毒素（Vat）

The Vacuolating Autotransporter Toxin (Vat) of Causes Cell Cytoskeleton Changes and Produces Non-lysosomal Vacuole Formation in Bladder Epithelial Cells.

• Juan Manuel Díaz
• Charles M Dozois
• Francisco Javier Avelar-González
• Eduardo Hernández-Cuellar
• Pravil Pokharel
• Alfredo Salazar de Santiago
• Alma Lilian Guerrero-Barrera

抄録

尿路感染症（UTI）は、毎年35億ドル以上のコストで、1億5000万人以上の人々に影響を与えています。尿路病原性（UPEC）は、宿主細胞にダメージを与える接着剤、シデロフォア、毒素などの病原性因子を持っています。Vacuolating autotransporter toxin (Vat) は、いくつかの尿路病原性（UPEC）株に存在するセリンプロテアーゼオートトランスポータータンパク質（SPATEs）のメンバーです。Vat は UPEC の 20～36％で確認されており、ウロ毒素分離株のほぼ 68％に存在しています。しかし、宿主細胞に対するVatの作用機序はよく知られていない。そこで、本研究では、膀胱細胞の尿膜モデルにおけるVatの効果を調べた。いくつかの毒素濃度を異なる時間帯で試験した結果、LDHアッセイで測定したように15〜47％の細胞損傷をもたらした。Vatは、時間依存的な方法で膀胱モデルの液胞形成を誘導した。Vat処理は、走査型電子顕微鏡で観察した膀胱細胞単分子膜上の細胞間コンタクトの喪失を示した。これはまた、ZO-1およびオクルーディンに対する抗体を用いて免疫蛍光により示された。さらに、上皮単分子膜の透過性の変化は、蛍光ベースの透過性アッセイを用いて示された。細胞損傷はまた、Vatによって生じる細胞骨格の変化の同定によって評価された。このように、Vat処理後、細胞はコントロール細胞と比較して、F-アクチン分布の変化とストレス線維の損失を示した。また、Vatはチューブリンを修飾したが、Arp3の分布には影響を与えなかった。Vatによって生成された空胞の性質を調べるために、酸性小器官を検出するための深赤色蛍光色素Lysotrackerを使用した。その結果、Vat処理した細胞では、酸性でない液胞が発生していることがわかった。マウス膀胱をVatに曝露した実験では、尿道膜の完全性が失われていることが示された。以上のことから、Vat は膀胱上皮細胞の細胞損傷、液胞形成、尿路バリアの異常を誘導することが示唆された。Vatによって誘導されたこれらの空胞の役割や尿路感染症の病態との関係を明らかにするためには、さらなる研究が必要である。

Urinary tract infections (UTIs) affect more than 150 million people, with a cost of over 3.5 billion dollars, each year. is associated with 70-80% of UTIs. Uropathogenic (UPEC) has virulence factors including adhesins, siderophores, and toxins that damage host cells. Vacuolating autotransporter toxin (Vat) is a member of serine protease autotransporter proteins of (SPATEs) present in some uropathogenic (UPEC) strains. Vat has been identified in 20-36% of UPEC and is present in almost 68% of urosepsis isolates. However, the mechanism of action of Vat on host cells is not well-known. Thus, in this study the effect of Vat in a urothelium model of bladder cells was investigated. Several toxin concentrations were tested for different time periods, resulting in 15-47% of cellular damage as measured by the LDH assay. Vat induced vacuole formation on the urothelium model in a time-dependent manner. Vat treatment showed loss of the intercellular contacts on the bladder cell monolayer, observed by Scanning Electron Microscopy. This was also shown using antibodies against ZO-1 and occludin by immunofluorescence. Additionally, changes in permeability of the epithelial monolayer was demonstrated with a fluorescence-based permeability assay. Cellular damage was also evaluated by the identification of cytoskeletal changes produced by Vat. Thus, after Vat treatment, cells presented F-actin distribution changes and loss of stress fibers in comparison with control cells. Vat also modified tubulin, but it was not found to affect Arp3 distribution. In order to find the nature of the vacuoles generated by Vat, the Lysotracker deep red fluorescent dye for the detection of acidic organelles was used. Cells treated with Vat showed generation of some vacuoles without acidic content. An experiment with mouse bladder exposed to Vat demonstrated loss of integrity of the urothelium. In conclusion, Vat induced cellular damage, vacuole formation, and urothelial barrier dysregulation of bladder epithelial cells. Further studies are needed to elucidate the role of these vacuoles induced by Vat and their relationship with the pathogenesis of urinary tract infection.

Copyright © 2020 Díaz, Dozois, Avelar-González, Hernández-Cuellar, Pokharel, de Santiago and Guerrero-Barrera.