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懸濁細胞を用いた高収量AAVベクター生産プラットフォームの構築
Creation of a High-Yield AAV Vector Production Platform in Suspension Cells Using a Design-of-Experiment Approach.
PMID: 32671134 PMCID: PMC7334306. DOI: 10.1016/j.omtm.2020.06.004.
抄録
組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ベクターは、主要な遺伝子送達プラットフォームであるが、ベクターの製造は依然として課題である。rAAV の収量を増やし、コストを削減するためには、新しい方法が必要です。rAAV生産を改善するためのこれまでの取り組みは、一度に単一の変数を最適化することに焦点を当ててきたが、このアプローチでは、ベクター生成に寄与する複数の要因の相互作用を考慮していない。本研究では、HEK293T懸濁細胞系でのrAAV産生を最適化するために、実験計画法（DOE）を用いた。本研究では、トランスジーン、パッケージング、ヘルパープラスミドの比率、総DNA濃度、細胞密度を同時に変化させ、52の条件で各変数の影響を系統的に評価した。結果は、トランスジーンプラスミドの低濃度、パッケージングプラスミドの高濃度、および以前に記載されたプロトコルよりも高い細胞密度を持つパラメータのユニークなセットを明らかにした。このDOEに最適化されたプロトコルを使用して、我々は、細胞培養の3×10ウイルスゲノム（VGs）/Lに近づく精製されていない収率を達成した。さらに、我々は、我々のダウンストリーム処理にポリエチレングリコール（PEG）ベースのウイルス沈殿、pH媒介タンパク質除去、およびアフィニティークロマトグラフィーを組み込んで、13の血清型とカプシドバリアントにまたがるrAAV-EGFPのための1×10 VGs/L以上の平均精製収率を可能にします。
Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors are a leading gene delivery platform, but vector manufacturing remains a challenge. New methods are needed to increase rAAV yields and reduce costs. Past efforts to improve rAAV production have focused on optimizing a single variable at a time, but this approach does not account for the interactions of multiple factors that contribute to vector generation. Here, we utilized a design-of-experiment (DOE) methodology to optimize rAAV production in a HEK293T suspension cell system. We simultaneously varied the transgene, packaging, and helper plasmid ratios, the total DNA concentration, and the cell density to systematically evaluate the impact of each variable across 52 conditions. The results revealed a unique set of parameters with a lower concentration of transgene plasmid, a higher concentration of packaging plasmid, and a higher cell density than previously described protocols. Using this DOE-optimized protocol, we achieved unpurified yields approaching 3 × 10 viral genomes (VGs)/L of cell culture. Additionally, we incorporated polyethylene glycol (PEG)-based virus precipitation, pH-mediated protein removal, and affinity chromatography to our downstream processing, enabling average purified yields of >1 × 10 VGs/L for rAAV-EGFPs across 13 serotypes and capsid variants.
© 2020 The Author(s).