エレクトロスプレーと層ごとの組立によるポリ電解質ドープマイクロカプセル内でのマルチ酵素カスケード反応の位置的組立

Positional assembly of multi-enzyme cascade reaction in polyelectrolyte doped microcapsule through electrospray and layer-by-layer assembly.

• Shiyi Che
• Jie Wang
• Xiaoyuan Ji
• Zhiguo Su
• Shaomin Wang
• Songping Zhang

抄録

ポリ電解質ドープマイクロカプセル(PDM)は、10mg/mLのカチオン性ポリ電解質ポリアリルアミン塩酸塩(PAH)を含むグリセロールと水の混合液をコア相溶液として、10wt%ポリウレタンのN,N-ジメチルアセチルアミド溶液をシェル相溶液として、グリセロールと水の同軸エレクトロスプレーにより作製した。カスケード反応のためのCandida Antarctica lipase B (CALB)、グルコースオキシダーゼ(GOD)、ワサビペルオキシダーゼ(HRP)を含むマルチ酵素系をPDM内に表面、シェル、ルーメンの3つの異なる場所で組み立てた。PDMの水性ルーメン内への酵素の配置は、同軸エレクトロスプレー用のコア相溶液に酵素を添加してカプセル化することで実現した。酵素とカチオン性界面活性剤 CTAB をイオンペアリングすることで、有機可溶性酵素-CTAB 複合体を調製し、酵素をシェル相溶液に添加することで PDM のシェル内への酵素の埋め込みを実現した。酵素の表面付着は、PDM中にドープされたPAHと酵素とのイオン交換相互作用を利用したLbL（layer-by-layer）技術により達成された。酵素修飾マイクロカプセルは、次に、マイクロバイオリアクターとして研究され、ここでは、１-オキソドデシル-α-グルコピラノシドがＣＡＬＢによりグルコースに変換され、第二段階ではＧＯＤによりグルコノラクトンに酸化された。生成された過酸化水素は、次いで、活性分析のためのカラーラジカルカチオンABTSを形成するためにABTSを酸化するためにHRPによって使用された。ＰＤＭの作製に成功し、異なる戦略による酵素のＰＤＭ内での正確な局在化が完全に特徴づけられた。固定化戦略を変えることで、3つの酵素を正確に配置した6つのPDMバイオリアクターを構築し、カスケード反応に対する活性を調査し、比較した。本研究では、新たなエレクトロスプレー技術を用いて作製したPDMマイクロバイオリアクターを用いて、多種類の酵素のカスケード反応を精密に制御して位置制御するためのスマートなプラットフォームを提供することを目的としている。

Polyelectrolyte-doped microcapsules (PDM) was fabricated by coaxial electrospray of a mixture of glycerol and water containing 10 mg/mL cationic polyelectrolyte poly(allylamine hydrochloride) (PAH) fed as the core phase solution, and a N,N-dimethylacetylamide solution of 10 wt% polyurethane fed as the shell phase solution. Multi-enzyme system involving Candida Antarctica lipase B (CALB), glucose oxidase (GOD), and horseradish peroxidase (HRP) for cascade reaction was assembled in the PDM at three different places, namely, surface, shell, and lumen. Placing of enzyme inside aqueous lumen of the PDM was realized by encapsulation through adding the enzyme in the core-phase solution for coaxial electrospray. By ion-pairing of enzyme with cationic surfactant CTAB, an organic soluble enzyme-CTAB complex was prepared, so that embedding of enzyme in the shell of the PDM was realized by adding it into the shell phase solution. Surface attachment of enzymes was achieved by layer-by-layer (LbL) technology, which is based on the ion-exchange interactions between oppositely charged enzymes and PAH that was doped in PDM. The enzyme-decorated microcapsule was then studied as a micro-bioreactor, in which 1-Oxododecyla-α-glucopyranoside was converted by CALB to glucose, which was oxidised by GOD to gluconolactone in a second step. The hydrogen peroxide produced was then used by HRP to oxidize ABTS to form coloured radical cation ABTS for activity analysis. The successful fabrication of the PDM and precise localization of enzymes in the PDM by different strategies were fully characterized. By varying the immobilization strategy, totally six PDM bioreactors with three enzymes precisely positional assembled in different strategies were constructed and their activities for the cascade reaction were investigated and compared. The PDM micro-bioreactor prepared by novel electrospray technologies provide a smart platform for positional assembly of multi-enzyme cascade reaction in a precise and well-controlled manner.

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