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蛍光標識された腸管出血性大腸菌滋賀毒素2Bサブユニットを検出するためのポータブルで高感度な光検出システム
A portable and high-sensitivity optical sensing system for detecting fluorescently labeled enterohaemorrhagic Escherichia coli Shiga toxin 2B-subunit.
PMID: 32673369 DOI: 10.1371/journal.pone.0236043.
抄録
我々は、蛍光標識された腸管出血性大腸菌（EHEC）滋賀毒素（Stxs）を検出するためのポータブル蛍光センサーとして使用するために、細胞サンプルから蛍光強度を高感度かつ高精度で読み取ることができるスタンドアロン型のリアルタイム光検出装置を開発した。一般に、蛍光標識されたStxsは、各細胞に結合している分子の数が少ないため、シグナル強度が弱いという問題がありました。この技術的課題を解決するために、高感度光検出器（光電子増倍管：PMT）を用いて蛍光を測定するとともに、光学部品を正確に配置するための携帯用光学ハウジングを設計し、ハウジング自体を3Dプリンターで製作しました。また、PMTの出力を増幅する電気回路を設計し、システムに組み込んだ。このシステムでは、試料中の毒素濃度を液晶ディスプレイ（LCD）に表示し、マイコン回路を用いてPMT出力の読み取り、処理データ、結果の表示を行う。他のポータブル蛍光検出器とは対照的に、このシステムは、周辺のコンピュータや追加の装置を一切使用せずに単独で動作し、その総サイズは約17×13×9cm3、重さは約770gである。我々は、毒素受容体グロボトリアオシルセラミド（Gb3）を発現する単球性THP-1細胞に結合したAlexa Fluor 488タグ付きStx2B-サブユニットを検出するために、ポータブルリアルタイム光センシングシステムを使用した。この装置は Gb3 陰性 PD36 細胞からのシグナルを検出しなかったため、毒素受容体を発現する細胞に結合した Stxs を特異的に検出することが可能であることが示された。食品サンプル中の細胞を蛍光標識するための迅速かつ自律的な方法の開発に続いて、ここに記載された光学検出システムは、現場で食品中の滋賀毒素の直接検出に使用することができます。
We developed a stand-alone, real-time optical detection device capable of reading fluorescence intensities from cell samples with high sensitivity and precision, for use as a portable fluorescent sensor for sensing fluorescently labeled enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) Shiga toxins (Stxs). In general, the signal intensity from the fluorescently labeled Stxs was weak due to the small number of molecules bound to each cell. To address this technical challenge, we used a highly sensitive light detector (photomultiplier tube: PMT) to measure fluorescence, and designed a portable optical housing to align optical parts precisely; the housing itself was fabricated on a 3D printer. In addition, an electric circuit that amplified PMT output was designed and integrated into the system. The system shows the toxin concentration in the sample on a liquid crystal display (LCD), and a microcontroller circuit is used to read PMT output, process data, and display results. In contrast to other portable fluorescent detectors, the system works alone, without any peripheral computer or additional apparatus; its total size is about 17 × 13 × 9 cm3, and it weighs about 770 g. The detection limit was 0.01 ppm of Alexa Fluor 488 in PBS, which is ten thousand times lower than those of other smartphone-based systems and sufficiently sensitive for use with a portable optical detector. We used the portable real-time optical sensing system to detect Alexa Fluor 488-tagged Stx2B-subunits bound to monocytic THP-1 cells expressing the toxin receptor globotriaosylceramide (Gb3). The device did not detect a signal from Gb3-negative PD36 cells, indicating that it was capable of specifically detecting Stxs bound to cells expressing the toxin receptor. Following the development of a rapid and autonomous method for fluorescently tagging cells in food samples, the optical detection system described here could be used for direct detection of Shiga toxins in food in the field.