日本語AIでPubMedを検索
Sf9細胞における迅速なウイルス様粒子生産のための非ウイルスプラットフォームの開発
Development of a non-viral platform for rapid virus-like particle production in Sf9 cells.
PMID: 32673687 DOI: 10.1016/j.jbiotec.2020.07.009.
抄録
昆虫細胞は、複数の組換え産物を生産する高い汎用性を示してきた。培養の容易さ、ヒト病原体による汚染リスクの低さ、および高い発現能力は、ウイルス様粒子（VLP）を生成するための魅力的なプラットフォームとなっている。バキュロウイルス発現ベクターシステム（BEVS）は、これらの複雑なナノ粒子を生成するために頻繁に使用されてきた。しかし、BEVSは、バキュロウイルス由来のタンパク質の発現に起因する望ましくない副作用だけでなく、下流段階でのいくつかの困難さを伴う。本研究では、ポリエチレニミン(PEI)を介在させたSf9細胞の一過性遺伝子発現(TGE)に基づくバキュロウイルスフリーシステムを開発した。DNA:PEIポリプレックス形成の網羅的研究を行い、実験計画法(DoE)と望ましさ関数を組み合わせて最適なTGE条件を決定した。TGEアプローチは、eGFP、hSEAP、HIV-1 Gag VLPを含む、構造的複雑性の異なる3つのモデル組換え産物の作製に成功した。Gagポリタンパク質と細胞膜の共局在化は蛍光顕微鏡で検出され、ナノ粒子追跡分析とフロービロメトリーはVLP製造プロセスをモニターするためのハイスループット技術として適用されました。VLP産生の分析から、細胞外小胞に対するVLPの比率が最も高いため、トランスフェクション後48時間がVLPの収穫に最適であることが明らかになった。これらの条件では、最大で1.9±0.8-10 VLP/mLが達成され、初期のトランスフェクション条件と比較して2.8倍の増加を示した。結論として、本研究で提案されたTGEアプローチは、昆虫細胞内でVLPおよび潜在的に他の組換え産物を迅速に生産するためのバキュロウイルスを含まないプラットフォームを提供する。
Insect cells have shown a high versatility to produce multiple recombinant products. The ease of culture, low contamination risk with human pathogens and high expression capacity makes an attractive platform to generate virus-like particles (VLPs). The baculovirus expression vector system (BEVS) has been frequently used to produce these complex nanoparticles. However, the BEVS entails several difficulties in the downstream phase as well as undesirable side-effects due to the expression of baculovirus-derived proteins. In this work, we developed a baculovirus-free system based on polyethylenimine (PEI)-mediated transient gene expression (TGE) of Sf9 cells. An exhaustive study of DNA:PEI polyplex formation was performed and the optimal TGE conditions were determined by the combination of Design of Experiments (DoE) and desirability functions. The TGE approach was successfully applied to produce three model recombinant products with different structural complexities, including eGFP, hSEAP and HIV-1 Gag VLPs. Cell membrane co-localization with the Gag polyprotein was detected by fluorescence microscopy, whereas nanoparticle tracking analysis and flow virometry were applied as high-throughput techniques to monitor the VLP production process. Analysis of VLP production revealed that 48 h after transfection were optimal for VLP harvesting since the ratio of VLPs to extracellular vesicles was the highest. In these conditions, a maximum of 1.9 ± 0.8·10 VLP/mL was achieved, representing a 2.8-fold increase compared to the initial transfection condition. In conclusion, the TGE approach proposed in this study provides a baculovirus-free platform to rapidly produce VLPs and potentially other recombinant products in insect cells.
Copyright © 2020. Published by Elsevier B.V.