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標的化された重亜硫酸塩シークエンシング。高感度でカバレッジの高いDNAメチル化評価のための新しいツールです
Targeted bisulfite sequencing: A novel tool for the assessment of DNA methylation with high sensitivity and increased coverage.
PMID: 32673938 DOI: 10.1016/j.psyneuen.2020.104784.
抄録
DNA メチル化分析は、ストレス研究においてますます利用されるようになってきています。利用可能な方法は、高価で手間がかかり、短い CpG ストレッチの解析やアッセイ感度の低さによって制限されることが多い。ここでは、大規模コホートにおける複数の候補遺伝子の同時調査のためのコスト効率の高い次世代シークエンシングベースの戦略を提示する。この方法を説明するために、我々は精神神経内分泌研究で一般的に評価されている4つの候補遺伝子の解析を提示する。グルココルチコイド受容体（NR3C1）、セロトニントランスポーター（SLC6A4）、FKBPプロリルイソメラーゼ5（FKBP5）、オキシトシン受容体（OXTR）。ＤＮＡメチル化標準物質（１００％；７５％；５０％；２５％および０％）および女性および男性ドナーのＤＮＡを３回の独立した試験で重亜硫酸処理し、ＮＲ３Ｃ１ １Ｆプロモーター領域からの４２個のＣｐＧ、ＳＬＣ６Ａ４ ５'調節領域の８４個のＣｐＧ、ＦＫＢＰ５イントロン７に位置する５個のＣｐＧ、およびＯＸＴＲのイントロン３に位置する潜在的なエンハンサーエレメントに位置する追加の１２個のＣｐＧのためのシーケンシングライブラリーを生成するために使用しました。さらに、境界性パーソナリティ障害（BPD）患者45人と健常者45人のDNAをアッセイした。すべてのサンプルのマルチプレックスライブラリをMiSeqシステム上でシーケンスし、amplikyzer2ソフトウェアを使用してすべてのCpGサイトの平均メチル化値を解析しました。結果は、同じ重亜硫酸塩変換されたDNAから生成されたレプリケートを調査する際のアッセイの優れた精度、および異なるメチル化されたDNA標準の分析によって示されたアッセイの非常に高い直線性（R > 0.9）を示した。BPDと健常対照との間のDNAメチル化を比較しても、生物学的に関連する違いは見られなかった。ここに記載されているような技術的アプローチは、標的化されたDNAメチル化分析を容易にし、ストレス関連表現型のエピジェネティック研究における網羅性と精度のギャップを埋めるために、高感度、コスト効率、高スループットのツールを表しています。
DNA methylation analysis is increasingly used in stress research. Available methods are expensive, laborious and often limited by either the analysis of short CpG stretches or low assay sensitivity. Here, we present a cost-efficient next generation sequencing-based strategy for the simultaneous investigation of multiple candidate genes in large cohorts. To illustrate the method, we present analysis of four candidate genes commonly assessed in psychoneuroendocrine research: Glucocorticoid receptor (NR3C1), Serotonin transporter (SLC6A4), FKBP Prolyl isomerase 5 (FKBP5), and the Oxytocin receptor (OXTR). DNA methylation standards (100 %; 75 %; 50 %; 25 % and 0 %) and DNA of a female and male donor were bisulfite treated in three independent trials and were used to generate sequencing libraries for 42 CpGs from the NR3C1 1 F promoter region, 84 CpGs of the SLC6A4 5' regulatory region, 5 CpGs located in FKBP5 intron 7, and additional 12 CpGs located in a potential enhancer element in intron 3 of the OXTR. In addition, DNA of 45 patients with borderline personality disorder (BPD) and 45 healthy controls was assayed. Multiplex libraries of all samples were sequenced on a MiSeq system and analyzed for mean methylation values of all CpG sites using amplikyzer2 software. Results indicated excellent accuracy of the assays when investigating replicates generated from the same bisulfite converted DNA, and very high linearity (R > 0.9) of the assays shown by the analysis of differentially methylated DNA standards. Comparing DNA methylation between BPD and healthy controls revealed no biologically relevant differences. The technical approach as described here facilitates targeted DNA methylation analysis and represents a highly sensitive, cost-efficient and high throughput tool to close the gap between coverage and precision in epigenetic research of stress-associated phenotypes.
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