治療用PSD-95阻害剤と細胞貫通ペプチドTatとの共役は、血液脳関門への付着、取り込み、浸透に影響を与える

Conjugation of Therapeutic PSD-95 Inhibitors to the Cell-Penetrating Peptide Tat Affects Blood-Brain Barrier Adherence, Uptake, and Permeation.

• Mie Kristensen
• Krzysztof Kucharz
• Eduardo Felipe Alves Fernandes
• Kristian Strømgaard
• Morten Schallburg Nielsen
• Hans Christian Cederberg Helms
• Anders Bach
• Malte Ulrikkaholm Tofte-Hansen
• Blanca Irene Aldana Garcia
• Martin Lauritzen
• Birger Brodin

抄録

新しい脳卒中治療法が必要とされている。PSD-95のシナプス後密度-95(PSD-95)/disc large/ZO-1(PDZ)ドメインと-メチル-D-アスパラギン酸(NMDA)受容体との間の相互作用を阻害することは、神経細胞の損傷を緩和するための戦略として示唆されてきた。この相互作用を阻害するために設計されたペプチドNR2B9cと-ダイマーは、血液脳関門（BBB）透過と神経細胞の取り込みを促進するために、細胞透過性ペプチドTatと結合している。Tat--二量体はTat-NR2B9cと比較して1000倍の標的親和性を示したが、治療効果の面では同じ程度の改善は見られなかった。Tat-NR2B9cとTat-ダイマーによるBBB透過性の違いがこの違いを説明していると考えられるが、Tat-NR2B9cとTat-ダイマーを直接比較した研究はない。そこで、本研究の目的は、Tat-NR2B9cとTat-ダイマーのBBB取り込みと浸透を比較することであった。本研究では、Tat-NR2B9cとTat-dimerを比較し、Tat-NR2B9cとTat-dimerを蛍光体TAMRAに結合させ、その化学的安定性を評価した。また，ウシ脳毛細血管内皮細胞とラットアストロサイトの共培養を用いて，内皮膜の結合と細胞への取り込み，内皮透過性を評価した．In vivoでのBBB透過は、2光子顕微鏡イメージングを用いてマウスを用いて実証した。TAMRA-Tat（0.4% ID/g）、TAMRA-Tat-NR2B9c（0.3% ID/g）、TAMRA-Tat-ダイマー（0.25% ID/g）の脳内蓄積を示したマウスの組織分布を評価した。結論として、Tamra-TatへのNR2B9cまたは-ダイマーの付着は、化学的安定性とBBBと相互作用し浸透するための結果として得られるコンストラクトの能力の両方に影響を与えることを実証した。

Novel stroke therapies are needed. Inhibition of the interaction between the postsynaptic density-95 (PSD-95)/disc large/ZO-1 (PDZ) domains of PSD-95 and the -methyl-D-aspartate (NMDA) receptor has been suggested as a strategy for relieving neuronal damage. The peptides NR2B9c and -dimer have been designed to hinder this interaction; they are conjugated to the cell-penetrating peptide Tat to facilitate blood-brain barrier (BBB) permeation and neuronal uptake. Tat--dimer exhibits 1000-fold better target affinity than Tat-NR2B9c, but the same magnitude of improvement is not observed in terms of therapeutic effect. Differences in BBB permeation by Tat-NR2B9c and Tat--dimer may explain this difference, but studies providing a direct comparison of Tat-NR2B9c and Tat--dimer are lacking. The aim of the present study was therefore to compare the BBB uptake and permeation of Tat-NR2B9c and Tat--dimer. The peptides were conjugated to the fluorophore TAMRA and their chemical stability assessed. Endothelial membrane association and cell uptake, and transendothelial permeation were estimated using co-cultures of primary bovine brain capillary endothelial cells and rat astrocytes. In vivo BBB permeation was demonstrated in mice using two-photon microscopy imaging. Tissue distribution was evaluated in mice demonstrating brain accumulation of TAMRA-Tat (0.4% ID/g), TAMRA-Tat-NR2B9c (0.3% ID/g), and TAMRA-Tat--dimer (0.25% ID/g). In conclusion, we demonstrate that attachment of NR2B9c or -dimer to Tat affects both the chemical stability and the ability of the resulting construct to interact with and permeate the BBB.